不同砧穗组合对猕猴桃溃疡病的抗性差异及机制分析

贺占雪，朱太富，李 欣，苏效兰，刘惠民，王连春

（1.西南林业大学 园林园艺学院，云南 昆明 650224；
2.丽江市经济作物工作站，云南 丽江 674100；
3.西南林业大学 林学院，云南 昆明 650224）

猕猴桃细菌性溃疡病（Kiwifruit bacterial canker）是一种由丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringaepv.actinidiae，Psa）引起的细菌性病害，被称为猕猴桃病害中的癌症，在全国各大猕猴桃产区不断蔓延，已经成为制约猕猴桃产业发展的重要瓶颈[1]。猕猴桃品种繁多，不同品种对溃疡病的抗性存在差异。猕猴桃种植过程中嫁接是最普遍的繁殖方法，通过嫁接可保持接穗品种的优良特性，提高抗病虫害、耐湿抗涝和抗寒等能力[2]。研究发现，选育抗性砧木进行嫁接，可以提高嫁接苗的抗逆性[3]。王绍辉等[4]研究发现，以抗根结线虫的番茄为砧木，嫁接后可以有效提高感病品种彩虹101 对根结线虫的抗性；
鲍文武[5]研究发现，猕猴桃抗旱砧木对嫁接植株生长发育的影响显著高于接穗对嫁接植株的影响；
马志尧[6]研究发现，猕猴桃嫁接苗的抗逆性显著优于实生苗。因此，利用野生猕猴桃抗逆性高、对环境的适应能力强等特点，选育抗病砧木，然后通过嫁接等方式改变优良栽培品种的抗逆性，筛选出优质资源应用于实际栽培，是防治猕猴桃溃疡病较高效、经济的方法。

植物生长在复杂的自然环境中，经常会遭遇逆境，遇到逆境时会启动自身防卫保护机制，首先通过调节体内渗透物质或相关酶类来提高自身抗逆能力[7-8]。因此，生化指标的变化在一定程度上可以反映植物的抗逆性。大量的研究结果表明，病原物侵染植物时会诱发一系列的防卫反应，植物体内过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）等防御酶活性以及可溶性糖、脯氨酸、丙二醛含量会发生变化[9-12]。石志军等[13]和高小宁等[14]的研究结果表明，猕猴桃体内防御酶活性以及可溶性糖、脯氨酸含量与猕猴桃抗溃疡病存在不同程度的相关性。因此，深入分析感病前后不同时期寄主植物体内的生理生化变化，有助于进一步了解寄主植物的抗病机制、病害的发生规律和影响因素。

目前，猕猴桃栽培品种大多数通过人工杂交、嫁接等方式选育所得，初期抗病性表现良好，后来在栽培管理技术、病虫害的多样性和环境条件等因素的影响下，抗病性逐渐减弱，受病虫害影响逐渐加重。我国拥有丰富的野生猕猴桃资源，许多野生猕猴桃的生物学特性、抗性、遗传多样性等特点还未被完全挖掘出来，野生猕猴桃资源还具有较大的利用和发展空间。因此，为充分利用我国丰富的野生猕猴桃资源，以筛选出的抗溃疡病野生猕猴桃为砧木、不同抗性水平的常见猕猴桃材料为接穗，分析感染Psa 病原菌后各嫁接组合对溃疡病的抗性情况及生理生化指标与病情指数的关系，筛选影响溃疡病发生的主要因素、最优组合及抗病性相关的主要生理生化指标，为今后猕猴桃溃疡病的防治、野生猕猴桃资源的利用以及抗病性分析提供理论依据。

1.1 试验地概况及试验材料

试验地位于西南林业大学温室大棚内（25°04′N、102°45′E），该地年平均气温为14.5 ℃，平均海拔为1 890 m，年降水量为1 031 mm，年日照时数为2 327.5 h，年蒸发量为1 856.4 mm，夏季多大风天气，相对湿度为74%，土壤为红壤土，属北亚热带气候类型，试验地光照充足，通风和排水良好。

试验所用砧木是从云南省不同地区采集的抗溃疡病野生猕猴桃，均为3年生实生苗，详细信息见表1。

表1 砧木信息Tab.1 Rootstocks information

试验所用接穗（表2）为云南省猕猴桃种植产业中种植面积较大、范围较广的3个主栽品种红阳、贵长、Hort16-A 以及西南林业大学林学院森林培育与利用课题组通过Hort16-A 种子繁殖选育得到的植株（简称：Hort16-A种子繁殖植株），穗条均采用1年生健壮枝条。接穗和砧木均按病原菌接种流程进行过抗性分析，得到与其他研究者一致的结果[15-16]，详细信息见表1—2。

表2 接穗信息Tab.2 Scions information

1.2 试验设计

试验设计4个因素，分别为砧木、接穗、Psa病原菌菌液浓度和接种方式；
每个因素设计4 个水平，Psa 病原菌菌液浓度分别为5×105、5×106、5×107、5×108cfu/mL，接种方式分别为注射接种、创伤接种、针刺接种、无伤接种（表3）。其中，注射接种：用注射器直接将Psa 病原菌菌液注射到枝干韧皮部内；
创伤接种：用刀片去除枝干约0.5 cm2的韧皮部，用浸过Psa病原菌菌液的脱脂棉覆盖伤口；
针刺接种：用接种针在枝条韧皮部上刺6～8 个孔，用浸过Psa 病原菌菌液的脱脂棉覆盖伤口；
无伤接种：用浸过Psa病原菌菌液的脱脂棉覆盖无损伤的枝条。嫁接成活6 个月后选择距离土壤5 cm 处枝干接种。试验采用L16（44）正交试验设计（表4）。每组合3次重复，每次重复10 株嫁接苗，接种时每株嫁接苗的Psa 病原菌菌液接种量均为10 μL，接种完成后用保鲜膜包裹接种部位保湿24 h，然后揭去保鲜膜。

表3 试验的因素和水平Tab.3 Factors and levels of the experiment

表4 L16（44）正交试验设计Tab.4 L16（44）orthogonal experimental design

1.3 测定项目及方法

接种前，采集健康植株的叶片；
接种后10、20、30、40 d，调查各处理的发病情况、发病部位、发病株数，并采集发病植株叶片。每个组合根据其重复次数，采集3 份混合样。所取样品均用液氮处理后置于-80 ℃保存，用于POD、PPO、SOD 活性及可溶性糖、脯胺酸、丙二醛含量的测定。其中，SOD 活性采用氮蓝四唑法测定[17]，POD 活性采用愈创木酚法测定[18]，PPO 活性采用邻苯二酚法测定[19]，可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定[20]，脯氨酸含量采用磺基水杨酸法测定[21]，丙二醛含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定[22]。

1.4 抗溃疡病分析

根据采集的数据，结合彭小列等[23]、李淼等[24]的研究方法，参照裴艳刚等[25]、涂美艳等[26]和石志军等[13]抗溃疡病等级划分标准[高抗（HR）：病情指数＜10；
R：10≤病情指数＜30；
T：30≤病情指数＜50；
S：50≤病情指数＜80；
高感（HS）：病情指数≥80]，对各组合的抗病性进行分级，筛选出抗病性较强的组合。

1.5 数据处理

试验数据采用SPSS 22.0、Excel 2021 等软件进行方差分析和相关性分析，采用Origin 22.0 软件进行作图。

2.1 不同嫁接组合对猕猴桃溃疡病的抗性分析

从表5 可知，接种Psa 病原菌后10 d 植株开始发病，各处理发病程度呈现出差异，发病最严重的是T13处理，其次为T8处理，T15处理未出现发病植株；
后期各处理病情指数随接种时间的延长逐渐增大。由于接种初期发病不明显，中期波动幅度太大，直至接种40 d 后发病才趋于平稳，因此，以40 d病情指数作为评价数据，发现T4、T6、T9、T15 处理表现为高抗，T12、T16 处理表现为抗病，T8、T11、T13、T14 处理表现为感病。其中，无伤接种处理（T4、T6、T9、T15）均为高抗，创伤接种处理（T2、T8、T11、T13）表现为耐病或感病，病情指数均大于无伤接种处理；
以高感材料红阳猕猴桃作接穗的处理T1、T5 表现为耐病，T9 表现为高抗，T13 表现为感病，有效提高了红阳猕猴桃的抗病性。综上，伤口是引起植株发病的主要因素，抗病砧木可以有效增强接穗抗性。

表5 不同嫁接组合对猕猴桃溃疡病的抗性分析Tab.5 Analysis of resistance of different kiwifruit grafting combinations to canker

2.2 影响猕猴桃溃疡病病情指数的关键因素及最优组合分析

在猕猴桃溃疡病发病过程中，病情指数是验证植株发病严重度的重要指标[14]。本研究采用极差分析影响病情指数的主次因素。由表6 可知，不同接种后时间，接种方式（D）均为影响病情指数的主要因素。其中，接种后10 d，不同因素对病情指数的影响程度表现为D＞A＞C＞B，最优组合为A1B3C2D4；
接种后20 d，不同因素对病情指数的影响程度表现为D＞C＞A＞B，最优组合为A1B3C1D4；
接种后30 d，不同因素对病情指数的影响程度表现为D＞C＞B＞A，最优组合为A1B3C1D4；
接种后40 d，不同因素对病情指数 的 影 响 程 度 表 现 为D＞C＞B＞A，最 优 组 合 为A1B3C1D4。综上，抗溃疡病的最优组合是A1B3C1D4。

表6 不同因素水平间猕猴桃溃疡病病情指数的极差分析Tab.6 Range analysis of disease index of kiwifruit canker among different levels of different factors

续表6 不同因素水平间猕猴桃溃疡病病情指数的极差分析Tab.6（Continued）Range analysis of disease index of kiwifruit canker among different levels of different factors

2.3 接种Psa病原菌对不同猕猴桃嫁接组合叶片生理生化指标的影响

2.3.1 保护酶活性

2.3.1.1 POD活性 图1显示，接种Psa病原菌后0～40 d，各处理猕猴桃叶片中的POD 活性总体上均随着接种后时间的推进呈现先上升后下降的趋势。在接种Psa 病原菌后0～20 d，随着接种后时间的推进，各处理POD 活性快速上升，20 d 时达到峰值，总体上高抗和抗病组合POD 活性上升幅度明显高于耐病和感病组合，其中，20 d 时上升最快的高抗组合T15 POD 活性比感病组合T8 提高了65.95%；
在接种Psa 病原菌后20～40 d，随着接种后时间的推移，各处理POD 活性呈下降趋势，到40 d时，高抗组合（T4、T6、T9、T15）分别比峰值时下降了69.16%、58.51%、72.76%、67.61%，而感病组合（T8、T11、T13、T14）分别比峰值时下降了39.24%、50.39%、65.56%、77.02%。

图1 接种Psa病原菌对不同猕猴桃嫁接组合叶片POD活性的影响Fig.1 Effect of inoculation of Psa on POD activity of different kiwifruit grafting combinations leaves

由表7可知，接种Psa病原菌后10～40 d，猕猴桃叶片中的POD 活性与溃疡病病情指数存在极显著负相关关系，相关系数分别为-0.905、-0.774、-0.879和-0.994。说明接种Psa 病原菌后，猕猴桃植株可通过调节体内POD 活性来抵御Psa 病原菌的侵害，提高自身抗病性。

表7 猕猴桃叶片POD活性与溃疡病病情指数间的相关性分析Tab.7 Correlation analysis between POD activity of leaves and disease index of kiwifruit canker

2.3.1.2 SOD活性 图2显示，接种Psa病原菌后0～40 d，随着接种后时间的推进，各处理猕猴桃叶片中的SOD 活性总体上均呈先上升后下降的趋势。其中，高抗处理（T4、T6、T9、T15）和抗病处理（T12 和T16）SOD 活性上升较快，于接种后20 d 到达峰值；
而耐病处理（T1、T2、T3、T5、T7、T10）和感病处理（T8、T11、T13、T14）上升较慢，于接种后30 d到达峰值，高抗和抗病处理SOD 活性上升幅度大于耐病和感病处理。

图2 接种Psa病原菌对不同猕猴桃嫁接组合叶片SOD活性的影响Fig.2 Effect of inoculation of Psa on SOD activity of different kiwifruit grafting combinations leaves

由表8可知，接种Psa病原菌后10～40 d，猕猴桃叶片中的SOD 活性与溃疡病病情指数存在极显著或显著负相关关系，相关系数分别为-0.842、-0.785、-0.541、-0.651，接种前期相关性更强。说明当植株受到Psa 病原菌侵害时，可以通过调节SOD 活性来提高自身抗病性。

表8 猕猴桃叶片SOD活性与溃疡病病情指数间的相关性分析Tab.8 Correlation analysis between SOD activity of leaves and disease index of kiwifruit canker

2.3.1.3 PPO 活性 图3 显示，接种Psa 病原菌后，随着时间推进，各处理猕猴桃叶片中的PPO 活性总体上均呈先上升后下降的趋势。高抗处理（T4、T6、T9、T15）、抗病处理（T12 和T16）和耐病处理（T1、T2、T3、T5、T7、T10）PPO 活性在被病原菌侵染后快速上升，接种后10 d达到峰值，其中，高抗处理T4上升速度最快，较0 d 时上升了166.06%；
感病处理（T8、T11、T13、T14）上升相对缓慢，于接种后20 d到达峰值，分别较接种前上升66.14%、40.42%、11.41%、12.11%。总体上，高抗和抗病处理PPO活性上升幅度大于耐病和感病处理。到达峰值后所有处理PPO 活性均开始下降，并逐渐趋于平稳，其中下降幅度最大的T2处理，比峰值时下降了69.42%。

图3 接种Psa病原菌对不同猕猴桃嫁接组合叶片PPO活性的影响Fig.3 Effect of inoculation of Psa on PPO activity of different kiwifruit grafting combinations leaves

由表9 可知，接种Psa 病原菌后10、20、40 d，猕猴桃叶片中的PPO 活性与溃疡病病情指数均呈极显著或显著负相关关系，接种后10 d 的相关系数为-0.836，接种后20 d 和40 d 的相关系数分别为-0.576 和-0.585；
而接种后30 d 时相关系数仅为-0.221，相关性不明显。总体上说明当植株受到Psa 病原菌侵害时，可以通过调节PPO 活性来提高自身抗病性。

表9 猕猴桃叶片PPO活性与溃疡病病情指数间的相关性分析Tab.9 Correlation analysis between PPO activity of leaves and disease index of kiwifruit canker

2.3.2 可溶性糖含量 图4 显示，接种Psa 病原菌后，随着时间的推进，各处理猕猴桃叶片中可溶性糖含量总体上均呈先上升后下降的趋势。在接种10～30 d 时，抗感病处理可溶性糖含量均呈上升趋势，抗病处理可溶性糖含量增加较慢，感病和耐病处理增加量明显高于抗病处理，之后呈缓慢下降的趋势。

图4 病原菌接种处理对不同猕猴桃嫁接组合叶片可溶性糖含量的影响Fig.4 Effect of inoculation treatment of pathogenic bacteria on soluble sugar content of different kiwifruit grafting combinations leaves

由表10 可知，接种Psa 病原菌后10～40 d，猕猴桃叶片中的可溶性糖含量与溃疡病病情指数均存在极显著负相关关系，相关系数分别为-0.686、-0.724、-0.885 和-0.876。说明当植株受到Psa 病原菌侵染时，可以通过调节可溶性糖含量来提高自身抗病性。

表10 猕猴桃叶片可溶性糖含量与溃疡病病情指数间的相关性分析Tab.10 Correlation analysis between soluble sugar content of leaves and disease index of kiwifruit canker

2.3.3 脯氨酸含量 图5 显示，接种Psa 病原菌后，随着时间的推进，猕猴桃叶片中脯氨酸含量总体上均呈现逐渐上升的趋势，高抗和抗病处理脯氨酸含量较耐病和感病处理增加快，提高幅度大。说明在植物受到Psa 病原菌侵害时，体内均能产生脯氨酸来调节渗透平衡，但抗病植株产生的脯氨酸更多。

图5 病原菌接种处理对不同猕猴桃嫁接组合叶片脯氨酸含量的影响Fig.5 Effect of inoculation treatment of pathogenic bacteria on proline content of different kiwifruit

由表11 可知，接种Psa 病原菌后10～40 d，猕猴桃叶片中脯氨酸含量与溃疡病病情指数均存在极显著或者显著负相关关系，相关系数分别为-0.650、-0.518、-0.806、-0.738，说明脯氨酸含量与植株的抗病性相关，可以作为抗性评价的生理指标。

表11 猕猴桃叶片脯氨酸含量与溃疡病病情指数间的相关性分析Tab.11 Correlation analysis between proline content of leaves and disease index of different kiwifruit grafting combinations canker

2.3.4 丙二醛含量 图6 所示，接种Psa 病原菌后，各处理猕猴桃叶片中丙二醛含量均呈现上升趋势，感病处理T8、T11、T13 和T14 丙二醛含量上升幅度较大，以T14 处理上升幅度最大，40 d 时T14 处理的丙二醛含量比0 d 时增加了0.84 μmol/g，而其余处理丙二醛含量变化幅度较平缓。总体上，感病处理丙二醛含量高于耐病处理，耐病处理高于抗病处理，且增加幅度也明显提高。说明接种Psa 病原菌后，抗病植株的膜脂过氧化程度较感病植株低。

图6 病原菌接种处理对不同猕猴桃嫁接组合叶片丙二醛含量的影响Fig.6 Effect of inoculation treatment of pathogenic bacteria on malondialdehyde content of different kiwifruit grafting combinations leaves

由表12 可知，接种Psa 病原菌后10～40 d，猕猴桃叶片中丙二醛含量与病情指数均存在极显著正相关关系，相关系数分别为0.509、0.546、0.785 和0.904，说明病情指数越大，丙二醛含量越高，丙二醛含量可以作为抗病性评价的生理指标。

表12 猕猴桃叶片丙二醛含量与溃疡病病情指数间的相关性分析Tab.12 Correlation analysis between malondialdehyde content of leaves and disease index of kiwifruit canker

近年来，随着猕猴桃商业化种植面积的不断扩大、种植年限的延长，品种特性退化，提高栽培品种的抗病性、挖掘抗病资源、寻找抗性砧木、丰富砧木种类，是今后猕猴桃种植管理过程中需研究的热点问题。考虑到优良砧木对适宜接穗的抗性、结果特性、果实品质等方面的影响，本研究以抗溃疡病野生猕猴桃为砧木、常规栽培猕猴桃品种及Hort16-A种子繁殖植株为接穗，研究了Psa 病原菌浓度和植株伤口的有无对猕猴桃溃疡病病情指数的影响。结果表明，接种方式为引发溃疡病的主要因素，其中创伤接种后各处理病情指数最大，说明日常管理过程中，植株的自然孔口和机械损伤是溃疡病菌侵染植株的主要渠道，在栽培过程中应避免猕猴桃植株受损伤，如果受损后应加强对植株机械损伤部位的消毒和杀菌处理，从而减轻溃疡病的发生。另外，本研究筛选得到最优组合A1B3C1D4（昭通猕猴桃为砧木、贵长猕猴桃为接穗、Psa病原菌菌液浓度5×105cfu/mL、无伤接种），说明抗病砧木可以有效改善接穗的抗病性，活体接种病原菌时选择适宜的接种浓度也比较重要，以试验筛选出的菌液浓度5×105cfu/mL对活体植株进行接种研究较适宜。

研究发现，SOD、POD 和PPO 活性均与植物抗逆性相关[27-29]。本研究结果表明，受溃疡病菌侵染后各处理猕猴桃叶片中SOD、POD 和PPO 活性总体均呈现出先上升到一个峰值后又缓慢下降的趋势，SOD 活性结果与其他植物受到逆境胁迫时的变化趋势一致[30-32]，但POD 活性结果稍有不同[33-34]，可能与病原菌种类和处理时间有关。

目前，关于可溶性糖含量与植物抗病性关系的研究较多，但针对不同的病害、不同的寄主植物以及不同病原菌，研究者们得出的结果并不一致[30，35-37]。本研究发现，在未接种Psa 病原菌前抗病植株的可溶性糖含量高于感病植株，接种Psa 病原菌后所有植株可溶性糖含量均增加，但是抗病植株可溶性糖含量增加缓慢，增加幅度小，感病植株可溶性糖含量快速增加，增加幅度大于抗病植株，这与钟程操[37]、李靖等[30]研究结果相似，但与石志军等[13]研究结果相悖，有待今后进一步深入研究。脯氨酸在植物的抗逆反应中，可以作为渗透调节物质、能源物质等，其含量可以作为植物抗病性评价指标[35]。本研究抗感病处理间猕猴桃叶片中脯氨酸含量的增长速度存在差异，抗病处理叶片中脯氨酸含量增加速度明显快于感病处理，且脯氨酸含量与病情指数呈显著或极显著负相关，该结果与高宁馨等[36]在油菜抗菌核病研究中得出的脯氨酸含量与品种抗病性关系一样。丙二醛是植物膜脂过氧化产物，丙二醛含量能够较好地反映植物受损伤的程度[22-23]。本研究发现，接种Psa 病原菌后，感病处理猕猴桃叶片中丙二醛含量快速增加，抗病处理丙二醛含量增加的速度较感病品种缓慢，说明抗病处理膜脂过氧化程度低，受损伤小。

猜你喜欢感病溃疡病抗病我国小麦基因组编辑抗病育种取得突破今日农业(2022年4期)2022-06-01冬季溃疡病高发 防治须加强基层中医药(2021年2期)2021-07-23土壤pH和主要养分含量与山核桃干腐病的相关性研究浙江林业科技(2021年3期)2021-07-13葡萄转色期干梗掉粒 多是溃疡病今日农业(2019年14期)2019-01-04甘蔗实生苗早期阶段黑穗病抗性鉴定与评价中国糖料(2018年4期)2018-07-315个欧亚种葡萄品种感染霜霉病后4种酶活性的变化长江大学学报(自科版)(2018年14期)2018-07-17猕猴桃溃疡病致病根源及防控对策现代园艺(2018年3期)2018-02-10北方杨树枝干溃疡病的发生与防治现代园艺(2018年14期)2018-01-18bZIP转录因子在植物激素介导的抗病抗逆途径中的作用浙江农业学报(2017年1期)2017-05-17葡萄新品种 优质又抗病新农业(2016年20期)2016-08-16