黑米花色苷矢车菊素-3-O-β-葡萄糖苷对脂多糖诱导的人THP-1单核细胞炎症损伤的保护作用

牙甫礼，李玮琪，马永洁，周昕榆，伍春婷，黄新惠

（1.大理大学公共卫生学院，云南 大理 671000；
2.大理大学代谢性疾病转化医学研究院，云南 大理 671000）

近年来，心血管疾病（cardiovascular diseases，CVDs）已经成为威胁我国居民健康的主要问题和突出的公共卫生问题，以动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）为典型特征的动脉血管结构和功能改变是心肌梗死、心力衰竭、脑卒中等CVD事件发生的共同病理生理学基础[1-2]。AS的发生发展涉及错综复杂的病理生理学变化，其中，慢性炎性学说一直受到高度认可与关注，被普遍认为是贯穿于AS各个时期的重要病理变化之一[3]。研究表明，由革兰氏阴性细菌来源的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是参与AS过程中血管炎症的重要成分之一，是AS发生发展的关键危险因素[4]。LPS可通过识别单核细胞和巨噬细胞等多种炎症细胞表面的Toll-样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4），进而介导细胞多种炎症因子的释放，并参与AS的发生发展过程[5]。研究证实，在LPS的作用下，单核细胞被异常激活，并黏附到损伤的血管内皮下，浸润血管壁，分化成巨噬细胞和泡沫细胞。同时活化的单核细胞分泌的炎症因子如白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等以及趋化因子可加速AS进展[6]。因此，抑制单核细胞炎症反应被认为是防治AS发生发展的重要靶点之一[7]。

有研究证实，营养干预是预防AS和心血管疾病的重要途径之一[8-9]。花色苷是一种多酚类黄酮化合物，富含于各种深色的蔬菜、水果及谷类中，如紫甘蓝、紫番薯、蓝莓、桑葚、葡萄、黑米和紫玉米等[10]。矢车菊素-3-O-β-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-β-glucoside，Cy-3-g）是花色苷中重要的单体物质，具有多种生物学活性[11]。流行病学、临床试验和动物实验研究表明，花色苷Cy-3-g可通过抗炎、抗氧化以及改善糖脂代谢紊乱等机制发挥抗AS和保护心血管疾病的作用[12-13]。前期研究发现，Cy-3-g参与调控血小板功能，进而发挥抗AS的作用。例如，体外细胞实验研究发现，Cy-3-g可抑制激动剂诱导的血小板聚集、活化和血栓形成[14]；
动物实验表明，膳食补充桑葚来源的Cy-3-g可抑制高脂血症小鼠血小板高反应性[15]；
人群干预研究提示膳食补充Cy-3-g能够显著抑制高脂血症患者血小板颗粒物的释放以及趋化因子的释放[13,16]。此外，体外研究也表明，花色苷单体如锦葵色素和花葵素-3-葡萄糖苷等可抑制单核细胞介导的炎症反应和氧化应激损伤[17-19]。但是黑米来源的花色苷单体Cy-3-g对LPS诱导的单核细胞损伤作用尚不清楚，本研究旨在通过体外实验探讨黑米花色苷Cy-3-g对LPS诱导的人单核细胞THP-1炎症损伤的影响及其可能的分子机制，从膳食营养或功能食品开发角度为黑米Cy-3-g防治AS和CVDs提供一定的理论和实验依据。

1.1 材料与试剂

实验所用黑米（Oryza sativaL.indica）购自本地超市，产地为东北。

人THP-1单核细胞 美国ATCC公司；
RPMI1640培养基、胎牛血清 美国Gibco公司；
双抗（青霉素、链霉素） 美国Thermo Fisher Scientific公司；
人IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α酶联免疫吸附测定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒 英国Abcam公司；
LPS 北京索莱宝科技有限公司；
Cy-3-g标准品 挪威Polyphenol AS公司；
一抗TLR4、核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）p65、NF-κB抑制因子（inhibitor of NF-κB，IκB）α、p-NF-κB p65（Ser536）、p-IκBα（Ser32）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）以及二抗羊抗兔 南京巴傲得（BioWorld）生物科技有限公司；
NF-κB p65的抑制剂Bay11-7082 美国Selleck Chemical公司；
mirVanaTMmiRNA分离试剂盒 美国Invitrogen公司。

1.2 仪器与设备

H1650R低温高速离心机、L500低速离心机 湖南湘仪实验仪器开发有限公司；
BCD-618WGHSSEDBL低温冰箱 青岛海尔有限公司；
CLARIOstar Plus多功能酶标仪 德国Bmg Labtech公司。

1.3 方法

1.3.1 黑米花色苷Cy-3-g的提取与纯化

黑米花色苷Cy-3-g的提取与纯化方法参照前期研究[20-21]。黑米糊粉层用磨粒脱壳机去除，糠皮用含0.1%（体积分数，下同）盐酸的60%（体积分数，下同）乙醇溶液浸泡5 h（料液比为1∶10），共浸提3 次，然后将浸提液进行抽滤，滤液于40 ℃下旋转蒸发至无乙醇为止。将浓缩液与石油醚充分混匀并静置5 h后进行脂质萃取，收集下层花色苷液体，收集液通过Amberlite XAD-7HP离子交换大孔吸附柱，吸附后用0.1%盐酸清洗和80%乙醇溶液洗脱，收集深色洗脱液。收集到的洗脱液在40 ℃水浴条件下旋转蒸发得到花色苷浓缩液，冻于-80 ℃冰箱，冷冻干燥后，得到花色苷粗提物粉末。

取0.6 g花色苷粗提物粉末溶解到25 mL体积分数5%盐酸酸化甲醇溶液中，制备花色苷浓缩液，然后进行中压制备液相色谱系统（加装有反相C18色谱柱）分析。以体积分数0.1%三氟乙酸（A液）和体积分数99.5%甲醇（B液）为流动相，进行梯度洗脱。线性梯度为6% B（0～10 min），20%～33% B（11～30 min），33%～40% B（31～90 min），40%～45% B（91～110 min），45%～100% B（110～115 min），100% B（115～135 min），50% B（135～150 min），流速设定为15 mL/min。最后用紫外检测器（254 nm为检测波长，280 nm为收集波长）检测洗出液，根据所得色谱图收集黑米中花色苷Cy-3-g组分，并冻存于-20 ℃中备用[20]。

1.3.2 黑米花色苷Cy-3-g纯度分析

采用高液相色谱二极管阵列检测器进行花色苷Cy-3-g纯度的鉴定，具体方法参照前期研究[21]。将提取所得的花色苷Cy-3-g冻干粉重悬于酸性甲醇（V（1 mol/L HCl）∶V（甲醇）＝85∶15）中，负载Zorbax SB-C18柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）。流动相由洗脱液A（体积分数10%甲酸水溶液）和洗脱液B（甲醇）组成，梯度洗脱程序为：0～1 min，2% B；
1～5 min，10% B；
5～20 min，10%～60% B。柱温为25 ℃，流速为0.2 mL/min，光电二极管阵列检测器测定波长为520 nm。将样品峰面积与标准曲线相比较，经前期实验分析，Cy-3-g的纯度高于96.5%[21]。

1.3.3 THP-1细胞培养

THP-1细胞用RPMI1640细胞完全培养基（含体积分数10%胎牛血清和体积分数1%双抗）于95%相对湿度、5% CO2、37 ℃的培养箱中培养。当细胞密度达到80%左右时进行细胞传代。于37 ℃、1 000 r/min离心5 min收集细胞，弃去旧的培养液，用配好的完全培养基重悬细胞，并接种于细胞培养皿中，继续放入培养箱中常规培养。取对数生长期的细胞用于实验，用终质量浓度为0.10、0.25 μg/mL和0.50 μg/mL的Cy-3-g分别与细胞共孵育4 h（溶剂对照组细胞中加入RPMI1640完全培养基），之后加入质量浓度50 ng/mL LPS溶液与细胞继续孵育48 h，收集细胞和上清液检测相应指标。

1.3.4 MTT比色法检测细胞毒性

细胞达到对数生长期后，将不同质量浓度Cy-3-g加入细胞悬液中，按5×104个/mL的密度接种于96 孔板中，放入培养箱中常规培养4 h后，加入或不加入LPS继续培养48 h，然后将细胞于37 ℃、1 000 r/min离心5 min，弃上清液，每孔加入质量分数0.5%噻唑蓝（3-(4,5-dimethyl-2-thiazyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromide，MTT）溶液，继续放入培养箱培养4 h后加入100 μL二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO），充分振荡溶解后，用酶标仪检测570 nm波长处各组吸光度，用吸光度表征细胞毒性。阴性对照组中不加Cy-3-g和LPS处理，其他处理条件相同。

1.3.5 THP-1细胞释放的IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平检测

细胞经Cy-3-g和LPS处理后，于37 ℃、1 000 r/min离心5 min，收集上清液，采用ELISA试剂盒对上清液中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平进行测定，检测方法按照试剂盒说明书进行。在探讨NF-κB信号通路在Cy-3-g调控LPS诱导的THP-1细胞炎症损伤的作用时，在加入或不加入质量浓度为10 μmol/L NF-κB特异性阻断剂Bay11-7082的条件下，用质量浓度为0.5 μg/mL Cy-3-g与细胞共孵育4 h，之后加入质量浓度50 ng/mL LPS溶液与细胞继续孵育48 h，采用ELISA试剂盒对上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平进行测定。

1.3.6 THP-1细胞中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、TLR4和NF-κB p65mRNA表达水平测定

细胞经Cy-3-g和LPS处理后，于37 ℃、1 000 r/min离心5 min，收集细胞，用pH值为6.8的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）润洗3 次后，用mirVanaTMmiRNA分离试剂盒进行总RNA提取。用1 μg RNA来进行逆转录合成cDNA，将cDNA进一步进行实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，mRNA相对表达量用2-ΔΔCT方法计算，以β-actin作为管家基因。所用引物序列见表1。

表1 定量PCR所用引物序列Table 1 Primers used for quantitative PCR

1.3.7 Western blot蛋白免疫印迹分析

细胞经Cy-3-g和LPS处理后，离心，收集细胞，用PBS润洗3 次后，对细胞进行裂解，常规提取蛋白，经测定蛋白质量浓度后，对样本进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白转到聚偏二氟乙烯膜后，用5%的脱脂奶粉溶液封闭1.5 h，用含体积分数1%吐温-20的Tris-盐缓冲液（Tris buffered solution with Tween-20，TBST）洗膜3 次后，于4 ℃避光孵育一抗TLR4、NF-κB p65、IκBα、p-NF-κB p65、p-IκBα（抗体与TBST体积比为1∶1 000）和GAPDH（抗体与TBST体积比为1∶10 000）过夜，洗膜后室温避光孵育二抗羊抗兔（抗体与TBST体积比为1∶20 000）1.5 h，最后用自动化学发光图像分析系统对条带进行曝光，以检测蛋白水平。条带灰度用Quantity One软件进行分析[22-23]，将目的蛋白的灰度与内参蛋白的灰度相比，并将阴性对照组蛋白比值设定为1进行数据的统计分析。实验至少重复3 次，每次实验的样本均来自独立的细胞培养。

1.4 数据处理与统计分析

实验数据用平均值±标准差表示。采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，多组间比较采用单因素方差分析，差异显著后采用Tukey法进行组间两两比较，双侧P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2.1 黑米花色苷Cy-3-g对THP-1细胞毒性的影响

通过采用MTT比色法检测黑米花色苷Cy-3-g对THP-1细胞毒性的影响。如图1所示，与阴性对照组相比，Cy-3-g在质量浓度0.10～10.00 μg/mL范围内对THP-1细胞活性无显著影响（P＞0.05）；
此外，在质量浓度50 ng/mL LPS的作用下，质量浓度0.10～0.50 μg/mL范围的Cy-3-g对THP-1细胞活性也无显著影响（P＞0.05）。结合前期的预实验和其他文献报道结果，最终选择质量浓度0.10、0.25 μg/mL和0.50 μg/mL进行后续实验。

图1 黑米花色苷Cy-3-g对THP-1细胞毒性的影响Fig.1 Cytotoxic effect of black rice-derived Cy-3-g on THP-1 cells

2.2 黑米花色苷Cy-3-g对LPS诱导的THP-1细胞炎症因子mRNA相对表达量和释放水平的影响

如图2所示，与阴性对照组相比，LPS可高度显著促进THP-1细胞IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α炎症因子的mRNA相对表达量（P＜0.001）；
与溶剂对照组相比，Cy-3-g在质量浓度0.10～0.50 μg/mL范围内均可显著抑制LPS诱导的IL-1βmRNA相对表达量升高（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001），质量浓度0.25 μg/mL和0.50 μg/mL的Cy-3-g可显著降低LPS诱导的IL-6和TNF-α炎症因子的mRNA相对表达量（P＜0.05、P＜0.001），但是质量浓度0.10 μg/mL Cy-3-g处理后则无显著抑制作用（P＞0.05）。与溶剂对照组相比，各质量浓度的Cy-3-g对LPS诱导的IL-8mRNA相对表达量均无显著降低作用（P＞0.05）。此外，质量浓度0.25、0.50 μg/mL的Cy-3-g较溶剂对照组，可极显著或高度显著提高IL-10mRNA相对表达量（P＜0.01、P＜0.001）。如图3所示，Cy-3-g对LPS诱导的THP-1细胞上述炎症因子释放水平的影响与其对相应炎症因子mRNA相对表达量的影响一致。

图2 黑米花色苷Cy-3-g对LPS诱导的THP-1细胞炎症因子mRNA相对表达量的影响Fig.2 Effect of black rice-derived Cy-3-g on the mRNA expression levels of inflammatory factors in THP-1 cells induced by LPS

图3 黑米花色苷Cy-3-g对LPS诱导的THP-1细胞炎症因子释放水平的影响Fig.3 Effect of black rice-derived Cy-3-g on the release levels of inflammatory factors in THP-1 cells induced by LPS

2.3 黑米花色苷Cy-3-g对LPS诱导的THP-1细胞TLR4/NF-κB信号通路的影响

如图4A、D所示，与阴性对照组相比，LPS可高度显著或显著上调THP-1细胞TLR-4 mRNA相对表达量和蛋白相对表达量（P＜0.001、P＜0.05）；
与溶剂对照组相比，TLR-4 mRNA相对表达量和蛋白相对表达量可被质量浓度0.25、0.50 μg/mL Cy-3-g显著下调（P＜0.01、P＜0.001、P＜0.05）。此外，如图4C、E、F所示，与阴性对照组相比，LPS可极显著抑制IκBα的表达（P＜0.01），并促进其磷酸化，质量浓度0.25、0.50 μg/mL Cy-3-g可显著逆转LPS的效应（P＜0.05、P＜0.01），说明Cy-3-g可抑制LPS诱导的IκBα降解和活化。同时，与阴性对照组相比，LPS诱导的NF-κB p65 mRNA相对表达量和蛋白相对表达量可被质量浓度0.25、0.50 μg/mL Cy-3-g显著下调（P＜0.01、P＜0.001、P＜0.05）（图4B、G），质量浓度0.25、0.50 μg/mL Cy-3-g可显著下调LPS诱导的NF-κB p65的磷酸化水平（P＜0.01、P＜0.001）（图4H）。以上实验结果表明，Cy-3-g可抑制LPS诱导的TLR4/NF-κB信号通路的活化。

图4 黑米花色苷Cy-3-g对LPS诱导的THP-1细胞TLR4/NF-κB信号通路的影响Fig.4 Effect of black rice-derived Cy-3-g on TLR4/NF-κB signaling pathway in LPS-induced THP-1 cells

2.4 NF-κB信号通路在黑米花色苷Cy-3-g调控LPS诱导的THP-1细胞炎症损伤中的作用

为了探讨NF-κB信号通路在Cy-3-g调控LPS诱导的THP-1细胞炎症损伤中的作用，采用NF-κB的特异性阻断剂Bay11-7082进行对比分析，结果如图5所示，与溶剂对照组相比，10 μmol/L Bay11-7082可高度显著降低LPS诱导的细胞IL-1β、IL-6和TNF-α释放水平（P＜0.001），但是Bay11-7082与Cy-3-g联合使用时无协同效果（Bay11-7082组与Cy-3-g+Bay11-7082组相比无显著性差异（P＞0.05））。以上实验结果表明，Cy-3-g对LPS诱导的THP-1细胞炎症损伤保护作用的机制可能是下调TLR4/NF-κB信号通路。

图5 NF-κB信号通路在黑米花色苷Cy-3-g调控LPS诱导的THP-1细胞炎症损伤中的作用Fig.5 Role of NF-κB signaling pathway in mediating LPS-induced inflammatory injury by black rice-derived Cy-3-g

AS是心血管疾病的重要病理变化之一，也是导致心血管疾病血栓形成的病理基础。细菌来源的LPS所介导的血管炎症反应在AS的发生发展过程中起关键作用[5]。营养膳食干预是防治AS形成的重要措施之一[8-9]。本研究首次证实黑米花色苷Cy-3-g可抑制LPS诱导的人THP-1细胞炎症损伤，从膳食营养或功能食品开发角度为黑米Cy-3-g防治AS和心血管疾病提供重要的理论和实验依据。

血管慢性炎症是诱导AS发生和发展的关键环节，在细菌感染如脓毒血症的状态下，主要由革兰氏阴性细菌来源的LPS介导的血管慢性炎症可诱导和加速AS的形成和发展[5]。在AS病变过程中，单核细胞是巨噬细胞的主要来源，单核-巨噬细胞的炎性浸润在其中发挥关键作用[24]。LPS可识别单核细胞表面的TLR4受体，进而介导胞内一系列信号通路，最终激活单核细胞，并促进其分化为巨噬细胞，同时伴随着炎症因子的释放[6]。研究表明，NF-κB信号通路在LPS-TLR4介导的炎症反应中起重要作用，LPS通过TLR4可激活下游的κB抑制因子激酶α/β（inhibitor of κB kinase α/β，IKKα/β），进一步促进IκBα在Ser32发生磷酸化，继而发生泛素化并逐渐被降解，使得IκBα与NF-κB p65的二聚体解聚，促进NF-κB p65发生活化，同时其在Ser536发生磷酸化后，进入细胞核，参与多种炎症因子如IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等mRNA转录，这些炎症因子最终从胞内释放到胞外，参与血管的炎症反应[25]。这些炎症因子进一步促使单核细胞黏附到损伤的血管内皮处，并向内膜下迁移转化为巨噬细胞，巨噬细胞可吞噬氧化低密度脂蛋白形成泡沫细胞，加剧AS的发生发展[24]。此外，LPS可直接促使M1型巨噬细胞释放IL-1β和IL-18等多种炎症因子，进而促进AS的发展[26]。同时，研究证实，LPS除了可以直接激活TLR4/NF-κB介导的信号通路外，还参与调控TLR4和NF-κB mRNA和蛋白的表达。LPS促进TLR4基因表达的机制可能是TLR4结合并识别LPS后，经髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依赖途径和MyD88非依赖途径（主要由Toll/IL-1受体结构域衔接蛋白介导）激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）和NF-κB信号通路，最终激活特异性蛋白（specific protein 1，SP-1），活化的Sp-1结合到TLR4基因的启动子上并促进基因的转录活化[27]。LPS通过TLR4介导多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1（poly(ADP-ribose) polymerase 1，PARP-1）发生活化，活化的PARP-1能够催化DNA结合蛋白发生聚二磷酸腺苷核糖化，并通过其氨基末端的DNA结合区域与NF-κB p65基因的特定序列启动子结合，进而促进NF-κB p65基因的转录表达[28-29]。

本研究发现，黑米花色苷Cy-3-g可抑制LPS诱导的IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表达和释放，这与已报道的花色苷其他单体如锦葵色素和花葵素-3-葡萄糖苷等调控THP-1细胞炎症反应结果一致[17-19]。IL-10对AS具有保护作用[30]，本研究发现黑米花色苷Cy-3-g可显著促进IL-10的mRNA表达和释放。此外，本研究结果还表明黑米花色苷Cy-3-g调控LPS诱导的THP-1细胞炎症损伤的机制可能主要是抑制TLR4/NF-κB信号通路，因为NF-κB的特异性阻断剂Bay11-7082与Cy-3-g联用时，两者没有协同抑制作用，说明Cy-3-g与Bay11-7082作用的靶蛋白（NF-κB）一致，进而表明Cy-3-g主要通过抑制NF-κB介导的信号通路来发挥抗炎作用。但是不同质量浓度Cy-3-g对LPS诱导的IL-8mRNA表达和释放无显著影响，说明Cy-3-g对不同炎症因子的调控机制可能不一样，这需要在今后的研究中进一步证实。此外，有研究表明，LPS通过TLR4还可激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B和腺苷酸活化蛋白激酶等信号通路，进而促进单核细胞的炎症反应[31-32]。因此，黑米花色苷Cy-3-g发挥抗炎作用是否还参与其他信号通路的调控，仍需要进一步证实。

花色苷属于植物化学物质中的多酚类黄酮化合物，在自然界中广泛存在于各种植物中，包括各种深色的蔬菜、水果及谷类。研究表明，膳食补充花色苷具有防治心血管疾病的作用[12-13]。然而，研究证明，膳食摄入Cy-3-g后，其原型在体内吸收利用率很低（通常低于1%）[33]。以50 mg/kgmb给予小鼠补充Cy-3-g，其血液中Cy-3-g的最大浓度约为0.4 μmol/L[34]。本研究采用的黑米花色苷Cy-3-g质量浓度范围为0.10～0.50 μg/mL，相当于0.2～1.0 μmol/L浓度，能发挥生物学效应的Cy-3-g质量浓度大多在0.25～0.50 μg/mL（0.5～1.0 μmol/L）之间，接近生理剂量，并且与其他报道的体外研究中所使用的花色苷单体浓度相一致[17]。之前的动物实验研究表明，膳食补充黑米花色苷Cy-3-g可抑制ApoE-/-小鼠血小板趋化因子及白细胞表面受体的表达[20]。由于膳食补充花色苷后，血液中的花色苷原型浓度很低，大多数研究提示膳食补充Cy-3-g生物学功效的发挥可能大部分归因于其肠道代谢物，如原儿茶酚酸等[33,35]。虽然本研究提示黑米花色苷Cy-3-g在体外实验中可显著抑制LPS诱导的THP-1细胞炎症损伤，但是其动物实验的体内效应尚不清楚，因此需要今后在脓毒血症模型的小鼠实验中探讨膳食补充Cy-3-g对单核细胞功能和炎症的调控效应。另外，研究表明Cy-3-g具有多种生物学功效，其作用特点存在多靶点效应，目前尚缺乏Cy-3-g靶点筛选的研究工作，本研究结果表明，Cy-3-g可能主要通过下调TLR4/NF-κB信号通路来实现抗炎作用，但是其确切的作用靶点需要今后结合基因芯片和蛋白组学等技术进行筛选。总之，本研究可从营养膳食或功能食品开发方面为黑米花色苷Cy-3-g防治心血管疾病提供一定的理论依据和应用参考。

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