基于网络药理学及分子对接探究茵栀黄颗粒治疗肝纤维化的作用机制

申凤霞，范建伟，李倩，马云，冯群，关永霞*

(1.鲁南厚普制药有限公司，山东 临沂 276006；
2.鲁南制药集团股份有限公司 中药制药共性技术国家重点实验室， 山东 临沂 276006；
3.山东新时代药业有限公司，山东 临沂 273400)

肝纤维化是肝脏结缔组织异常增生，这些结缔组织增生是由肝炎所导致的肝细胞的损伤所致。当纤维化达到一定程度，纤维化组织会形成肝硬化的结节，逐渐变成肝硬化，甚至是肝衰竭[1]。现代分子生物学研究发现，肝纤维化是由多因子、多细胞共同参与的一个复杂的动态病变，活化的肝星状细胞是参与肝纤维化形成与发展的主要细胞，其中涉及多个靶点和多条通路[2-3]。早发现、早治疗是肝纤维化治疗的重要手段，干预肝纤维化进程是该病治疗过程中极其重要的关键环节，因此寻求有效阻止肝纤维化进程的药物是目前研究的热点之一[2]。

中药在肝病的治疗过程中有其独特的优势，具有多成分、多靶点、多通路的协同调控作用机制，在治疗肝病的同时兼顾机体的整体调节[4-5]，符合中医治病的整体观念。茵栀黄颗粒源于《伤寒论》中的茵陈蒿汤,是由茵陈、栀子、黄芩、金银花4味药物的提取物制成的中药制剂，具有清热解毒、利湿退黄的功效，临床上主要用于各种肝炎的治疗[6]。方中茵陈味苦性微寒，善能清热祛湿、利胆退黄，为君药；
栀子清三焦火邪，除肝胆湿热而退黄；
黄芩清热燥湿、泻火解毒，与栀子共为臣药；
金银花甘寒，清热解毒，用为佐药，全方清热解毒、利湿退黄。现代药理学研究证实，茵栀黄颗粒具有利胆退黄，保肝利胆，治疗肝炎、肝纤维化以及肝内胆汁淤积的作用[7-8]。

随着医学的高速发展和大数据时代的到来，网络药理学应运而生，并能很好地与中医药整体观、辨证论治不谋而合[5]。网络药理学通过构建成分-靶点-疾病等相互作用网络，从整体角度来研究药物对整个机体的影响，揭示中药复方多成分、多靶点、多通路协同增效的作用机制，为中药复方物质基础和作用机制研究提供新的方法[9]。分子对接能够预测化合物与靶蛋白之间的亲和力，已成为计算机辅助药物研究领域的一项重要技术。由于目前缺乏茵栀黄颗粒对肝纤维化治疗的物质基础、作用靶点、通路调控机制的深入研究，本文借助网络药理学和分子对接方法筛选茵栀黄颗粒有效成分、作用靶点及其作用机制，为其临床应用提供理论依据。

1.1 茵栀黄颗粒活性成分及靶点的收集

运用中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform, TCMSP)和中国知网、万方、维普三个数据库的文献检索，分别收集茵栀黄颗粒中茵陈、栀子、黄芪、金银花4味中药的的化学成分，以口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%和类药性(drug-likeness, DL)≥0.18为筛选条件[10-11]筛选出茵陈、栀子、黄芪、金银花的活性成分。潜在活性成分的SMILE结构式利用PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)进行搜集，并导入SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)进行靶点预测。

1.2 茵栀黄颗粒与肝纤维化相关靶点的筛选

从GeneCards(https://www.genecards.org/)数据库中下载与肝纤维化相关的靶点，将上述SwissTargetPrediction预测得到的靶点与从GeneCards数据库下载的肝纤维化的靶点在Venn2.1.0中取交集，获取共有靶点作为茵栀黄颗粒治疗肝纤维化相关的靶点，用于下一步的分析。

1.3 化合物-靶点网络构建与分析

将茵栀黄颗粒的候选活性成分与靶点的一一对应关系导入到Cytoscape3.9.0软件，构建化合物-靶点网络图，节点分别代表化合物和靶点，边代表化合物与靶点的相互作用关系，采用Network Analyzer插件分析网络拓扑性质,计算节点的度值(degree)。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建与分析

利用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction, PPI)网络图，将茵栀黄颗粒作用于肝纤维化相关的靶点导入STRING数据库，物种选择“Homo sapiens”，置信度设定为≥0.5，获得蛋白质之间的的相互作用关系，并以TSV格式保存下载，导入Cytoscape3.9.0软件，分析网络拓扑性质，根据度值筛选核心靶点。

1.5 GO功能富集和KEGG通路富集分析

将茵栀黄颗粒与肝纤维化的相关靶点输入DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)数据库，分别进行基因本体(gene ontology, GO)功能富集分析和基于京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析，GO富集分析以P<0.05为筛选条件，选取下载结果中P值小于0.05的前15个生物学条目绘制条形图。KEGG富集分析同样以P<0.05为显著富集筛选条件，选取P<0.05的前15条信号通路绘制气泡图进行可视化分析。

1.6 分子对接

茵栀黄颗粒中主要活性化合物的3D结构从PubChem数据库中下载，核心靶蛋白的3D结构从Protein Data Bank(https://www.rcsb.org/)数据库下载。用Pymol软件对核心靶蛋白进行去除溶剂分子等的初步处理，再用AutoDock Tools进一步加氢处理、加电荷处理，将核心靶蛋白和活性化合物保存为“pdbqt”格式的文件，并设置合适的格子位置和大小，最后，由Autodock Vine完成成分和靶点的对接。

2.1 茵栀黄颗粒活性成分的收集及靶点预测

通过TCMSP数据库，检索茵栀黄颗粒中的4味药，共得到530个成分，其中茵陈53个，栀子98个，黄芩143个，金银花236个。以同时满足OB≥30%和DL≥0.18为筛选条件，分别得到茵陈有效成分13个，栀子12个，黄芩14个，金银花11个，删除重复的共有成分，共计43个活性成分。一味药可以含有多种活性成分，同一个活性成分也可以来自多味药，表明不同中药之间具有共同活性成分，与中药具有多成分、多靶点的协同作用机制是一致的，配伍使用具有协同增效的作用，为方便后续研究，这些成分被编号为MOL01～MOL43。通过SwissTargetPrediction数据库预测出茵栀黄颗粒的43个活性成分潜在作用靶点，删除靶点重复项后，得到778个靶点。

2.2 肝纤维化的相关靶点的收集及茵栀黄颗粒治疗作用靶点的筛选

通过筛选GeneCards数据库的检索结果，选取相关性得分≥10的前500个肝纤维化的靶点，与茵栀黄颗粒有效成分的778个靶点取交集，二者映射后确定了111个共同作用靶点，作为茵栀黄颗粒作用于肝纤维化的潜在靶点，见图1。

图1 茵栀黄颗粒和肝纤维化交集靶点的维恩图Fig.1 Venn diagram of the intersection targets of Yinzhihuang Granules and liver fibrosis

2.3 茵栀黄颗粒化合物-靶点网络构建与分析

茵栀黄颗粒的化合物-靶点网络图见图2，该网络图有154个节点，其中包括活性化合物43个(三角形)，潜在靶点111个(圆形)，717条边，边代表化合物与靶点之间的靶向关系。43个活性成分作用于111个靶点，在一定程度上体现了中医药通过不同的活性成分作用于同一靶点，以及同一活性成分作用于多个靶点的作用机制。采用插件分析网络拓扑性质，在网络图中，节点的大小代表该节点度值的大小，度值越大，表明该节点在该网络中的枢纽作用越强，度值排名前15的主要成分见表1，43个活性成分的详细信息见OSID科学数据与内容附表1。基于此分析发现活性成分中槲皮素节点的度值最大，其次为β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚、栀子苷、绿原酸、黄芩苷等。

表1 茵栀黄颗粒的主要活性成分Table 1 Fifteen main active ingredients of Yinzhihuang Granules

图2 活性成分-靶点网络图Fig.2 Network diagram of the active ingredient targets

2.4 PPI网络图分析

将111个茵栀黄颗粒治疗肝纤维化相关的靶点导入STRING数据库，获得PPI关系，随后导入Cytoscape3.9.0软件进行分析，见图3。采用Network Analyzer插件分析网络拓扑性质，计算度值，设置颜色的深浅和节点的大小反映度值的大小，根据度值的大小选出6个核心节点，分别是STAT3、AKT1、IL-6、TNF、EGFR、SRC，基于此推测这6个靶点为茵栀黄颗粒治疗肝纤维化的关键靶点。

图3 PPI网络Fig.3 PPI network

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路分析

利用DAVID数据库对筛选出的与肝纤维化相关的111个靶点进行GO富集分析，分别选取P<0.05的生物过程(biological process, BP)、分子功能(molecular function, MF)、细胞组成(cellular component, CC)的前15条目绘制条形图，如图4所示。纵坐标代表GO的各个条目，横坐标代表富集到与该条目的靶点数目。BP主要涉及凋亡过程的负调控、细胞增殖的正调控、蛋白质磷酸化的正调控、内皮细胞增殖的正调控等；
MF主要包括酶结合、受体结合、蛋白酶结合等；
CC主要包含线粒体、蛋白质复合物、细胞内膜结合的细胞器等。

图4 GO功能富集分析Fig.4 GO functional enrichment analysis

利用DAVID数据库对靶点进行KEGG通路富集分析，一共富集得到110条信号通路，本研究选取下载结果中P<0.05前20条通路绘制气泡图进行可视化分析，如图5所示。富集结果显示主要涉及PI3K-Akt信号通路、乙型肝炎、丙型肝炎、VEGF信号通路等信号通路，通路之间通过发挥协同作用起到治疗肝纤维化的作用。

注：图中气泡大小代表通路富集的靶点个数；
图中的颜色的变化代表P值的大小。图5 KEGG 通路富集分析Fig.5 Enrichment analysis of the KEGG pathway

2.6 分子对接

根据活性成分-靶点网络图里活性成分度值的排名以及文献调研[12-15]，本研究将活性成分槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚、栀子苷、绿原酸、黄芩苷与PPI网络里的排名前6的核心靶点STAT3、AKT1、IL6、TNF、EGFR、SRC进行分子对接，部分结果见表2，全表详见OSID科学数据与内容附表2。其结合能均小于-20 kJ/mol，结合能越小表示结合活性越高，化合物越容易与该靶点结合。黄芩苷与EGFR结合能最低，其次是黄芩苷与STAT3，表明黄芩苷与EGFR、STAT3结合活性最强，分子对接情况如图6所示。

表2 部分化合物与靶点分子对接结果Table 2 Molecular docking results of the compounds and targets

图6 化合物与靶点分子对接图Fig.6 Molecular docking diagram of the compounds and targets

茵栀黄颗粒源自中医经典名方“茵陈蒿汤”,现代药理研究表明茵栀黄颗粒具有清热解毒、利胆退黄、促进肝细胞再生、光谱抗菌等功效[16]。临床研究发现，茵栀黄颗粒可明显降低酒精肝患者的炎症反应[4]，具有抑制肝细胞炎性病变、积极调控肝内微循环、增强胆管收缩力，促进胆汁分泌与排泄[16]的功效。茵栀黄颗粒在肝病的治疗中已得到广泛应用，为了深入研究茵栀黄颗粒治疗肝纤维化的作用机制，本研究采用网络药理学的方法，借助多个数据库收集得到茵栀黄颗粒中530个成分和其对应的778个靶点，根据OB和DL参数筛选出43个活性成分，其中111个靶点与肝纤维化相关。

通过分析化合物-靶点网络图，发现槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚、栀子苷、绿原酸、黄芩苷有较高的度值，其对应的靶蛋白数目相对于其他成分较多，可能是茵栀黄颗粒治疗肝纤维化的主要有效成分。其中槲皮素的度值最高，该复方中的的槲皮素来自茵陈、栀子和金银花3味药材，在肝脏疾病领域，槲皮素在非酒精性脂肪性肝病和肥胖症中表现出调节脂肪、调节肠肝轴、稳定肝星状细胞以减少纤维化和影响丙型肝炎病毒生命周期的能力[12,17]，研究发现槲皮素可通过上调IL-10和HO-1的表达从而抑制NLRP3炎症小体激活和炎症因子分泌，进而发挥对急性酒精性损伤肝的保护作用[12-13]。β-谷甾醇是茵栀黄颗粒中茵陈、栀子、黄芩、金银花4味药材均含有的成分，研究表明，β-谷甾醇能抑制血清中酒精引起的生化指标的变化，减轻酒精引起的氧化应激，例如恢复红细胞膜流动性、减少谷胱甘肽消耗、恢复抗氧化酶活性和减少丙二醛的过度产生，β-谷甾醇还可以通过PI3K/Akt通路下调凋亡相关基因的表达[14]。此外，β-谷甾醇成功地减轻了二甲基亚硝胺诱导的小鼠肝损伤，并防止了胶原的积聚，具有抗肝脏纤维化的功效[18]。木犀草素是金银花的活性成分，能够降低小鼠肝指数和血清中AST、ALT的水平，改善肝细胞脂肪变性和炎性细胞浸润、坏死，对酒精所致小鼠急性肝损伤具有保护作用[15]。山奈酚对四氯化碳引起的小鼠急性肝损伤具有保护作用，显著降低肝细胞坏死和炎症细胞浸润的范围和程度[19-20]。栀子苷为栀子的主要活性成分，也是《中国药典》要求的检测成分，能够下调炎性因子TNF-α、IL-1和IL-6的表达，抑制TLR4表达NF-κB的活化，起到抗炎的作用，此外还具有改善肝纤维化的功能[21-22]。绿原酸是一种多酚类化合物，具有抗氧化和抗炎特性，已有研究表明绿原酸可以有效地减轻大鼠肝纤维化，通过抑制炎性因子的表达在急性酒精性肝损伤中起到保护作用[23-24]。黄芩苷能够改善肝功能和炎症指标，对肝脏起到保护作用，已有研究表明黄芩苷有效地减轻了MCD饮食诱导的肝脂肪变性、炎症、纤维化和细胞凋亡，黄芩苷的这些调节作用是通过调节脂质代谢、抑制促炎细胞因子如TNF-α等进而预防肝纤维化[25]。此外还有研究证明，黄芩苷通过抑制氧化应激，从而减少炎症和细胞凋亡，对ATO诱导的急性肝损伤具有保护作用，通过调控STAT3等关键蛋白进而调控JAK2/STAT3信号通路参与对肝脏的保护作用[26]。

本研究通过对PPI网络拓扑学分析发现，排名前6位的核心靶点分别为STAT3、AKT1、IL6、TNF、EGFR、SRC。信号转导和转录激活因子3(STAT3)通过参与肝星状细胞的增殖和活化进而参与到肝纤维化的过程中，在肝细胞中，适度表达的STAT3可促进肝细胞再生，有助于肝脏的修复，但是STAT3的过表达导致肝星状细胞活化、过度增殖，诱发肝纤维化，甚至是肝脏癌变[27]。AKT1参与调节机体生长代谢和血管生成等多个过程，研究显示，哺乳动物雷帕霉素复合物靶蛋白2(mTORC2)在c-Myc驱动的小鼠肝细胞癌中被激活，导致AKT1磷酸化激活，c-Myc的激活与磷酸化AKT1的表达密切相关。AKT1高表达与肝癌患者生存期差有关，AKT1的缺失可完全阻止小鼠c-Myc诱导的肝细胞癌形成[28]，调节AKT1诱导血管新生、保护血管，从而改善肝纤维化[29]。白细胞介素6(IL-6)是一种在体内具有多种生物学功能的细胞因子，在正常生理条件下，是肝组织稳态、肝脏再生、抗病毒和代谢功能微调所必需的。IL-6是适应性免疫的重要调节剂，诱导T细胞分化并调节自身免疫。IL-6可以增强抗病毒适应性免疫反应并减轻慢性感染期间T细胞的耗竭，是调节肝脏再生和支持效应免疫功能的关键因素，表明IL-6的这些功能可用于肝脏病治疗[30-31]。TNF-α可以诱导多种致纤维化、致炎因子产生，对肝纤维化的启动及调控起重要作用，TNF-α是激活肝星状细胞持续活化的核心细胞因子，肝星状细胞的持续性活化是肝纤维化发生的病理基础，由此推测抑制TNF-α的表达有助于减缓细胞凋亡的发生和肝纤维的启动[32]。Scheving等[33]研究发现，表皮生长因子受体(EGFR)及其配体与肝纤维化有关，降低EGFR的表达，可以抑制肝纤维化过程中血管生成和肝星状细胞活化，进而逆转部分肝组织的纤维化[34-35]。已有研究表明，SRC在硫代乙酰胺诱导的小鼠肝纤维化模型和肝硬化患者中表达上调，磷酸化的SRC在肝星状细胞活化过程中上调，抑制SRC可以降低原代肝星状细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达，并抑制转化生长因子β(TGF-β)诱导的肝细胞中结缔组织生长因子(CTGF)的表达，这些结果表明SRC在肝纤维化中起重要作用，抑制SRC的过表达可以防止肝纤维化[36]。

从KEGG通路富集中可知茵栀黄颗粒治疗肝纤维化可能通过PI3K-Akt信号通路、乙型肝炎、丙型肝炎等关键通路发挥作用。PI3K-Akt信号通路的激活可以调控下游蛋白参与细胞增殖凋亡等一系列的生理活动，通过抑制PI3K-Akt通路信号的传导来降低机体的氧化应激反应、降低炎性因子的表达水平，对活化的肝星状细胞有抑制作用，可以阻止肝纤维化的进一步发展[37]。并基于分子对接初步模拟活性成分与靶标之间可能的分子作用机制，结合能的大小直接反映预测结果的可靠性，其结合能均小于-20 kJ/mol，结合能越小表示结合活性越高，表明化合物越容易与该靶点结合。

综上所述，本研究利用网络药理学和分子对接技术，初步阐明了茵栀黄颗粒多成分、多靶点、多通路协同增效治疗肝纤维化的作用机制。茵栀黄颗粒可能是通过槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚、栀子苷、绿原酸、黄芩苷等活性成分，作用于STAT3、AKT1、IL6、TNF、EGFR、SRC等靶点，参与多通路的调控，通过抗炎、抑制氧化应激反应和肝星状细胞的活化等发挥治疗肝纤维化的作用。该研究为进一步验证茵栀黄颗粒治疗肝纤维化的相关靶点及通路提供了依据，为茵栀黄颗粒新功能的发现以及治疗肝纤维化新药的开发提供了一定的参考依据，同时为深入开发茵栀黄颗粒提供了方法学支撑，也为后续的基础机制研究奠定了基础。但本研究仅从网络药理学和分子对接层面来探究茵栀黄颗粒抗肝纤维化作用的有效活性成分及作用靶点，存在一定的局限，因此在后续的研究中将进行分子生物学验证，并结合体内外实验进行进一步的验证。

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