粪便SDC2,和NDRG4,基因甲基化检测在结直肠癌筛查中的应用分析

金文文，张 晓，刘 龙，周 琼，毛玉环，谭咸操，谭黎明

（湖南师范大学附属第一医院/湖南省人民医院，长沙 410000）

引言在全球范围内，结直肠癌是三大最常见的恶性肿瘤，也是癌症死亡率的重要原因之一［1，2］。在中国，由于人们生活水平的提高，饮食习惯发生改变，结直肠癌的发病率和死亡率成逐年增长趋势，在中国的发病率和死亡率居于第二位和第五位。结直肠癌早期通常无临床症状，大约5%的早期结直肠癌可以得到确诊，多数患者确诊时已属于中、晚期［3］，其治疗及预后情况不佳；
而早期及时发现、早治疗5 年生存率可达90%，所以，结直肠癌的早发现、早诊断是降低结直肠癌患者的发病率和死亡率的关键。因此，加强中国结直肠癌筛查及发现合适有效的筛查方法，从而提高早期肿瘤的检出率和降低病死率有重要意义。近年来，肿瘤标记物的联合检测对提升肿瘤早期诊断在临床应用中较为多见。我国的一项研究结果表明血清AFP、CEA 及CA125 的联合检测可明显提高原发性肝癌的阳性检出率［4］。粪便基因甲基化作为一种易保存、高检出率、灵敏度较高、特异性较好的无创性结直肠肿瘤标志物，能通过其阳性结果对疑似病例进行进一步检测，可作为筛查诊断结直肠肿瘤的一种重要的辅助手段。结直肠细胞更新速度比较快，一般每天结直肠脱落细胞大约有1010 个，与正常大肠黏膜相比，结直肠癌时的大肠黏膜脱落细胞数量更多，所以通过分析粪便脱落癌细胞和游离DNA 甲基化的状况可进行有效的大肠癌筛查［5-6］。SDC2 为syndecan 家族，可以编码完整的膜蛋白，该膜蛋白被高度糖基化以充当细胞外基质成分的受体。在结直肠癌中，SDC2 基因启动子区发生异常甲基化，可做为肿瘤标志物用于结直肠癌的筛查［7-10］。NDRG4（N-mycdownstream-regulatedgene4）为抑癌基因NDRG 基因家族成员，此基因家族在人体多数其他正常组织中高表达，在一些肿瘤组织中，NDRG4 不表达或低表达，而低表达则可能与DNA 启动子区域的高甲基化相关。该基因5"端调控区域内含有的CpG 岛容易在结直肠癌发生发展过程中被检出甲基化状态［11-12］。因此，本研究作为研究对象，旨在通过对粪便SDC2 和NDRG4 基因甲基化检测与结直肠癌的关联性，来判断人粪便SDC2 和NDRG4 基因在结直肠癌筛查中的临床价值。

1.1 病例选择与一般资料选择 湖南省人民医院2020年9 月1 日～2020 年12 月31 日期间住院收治的结直肠癌高危人群共32 例作为研究对象，年龄30～85 岁，其中男性16 例，女性16 例。纳入标准：①有大便习惯改变（慢性腹泻，慢性便秘）；
大便性质改变（粘液便，便血）；
大便次数增多，＞3/天，腹部固定部位疼痛的患者；
②原因不明的贫血患者；
③有炎症性肠病病史；
④有结直肠癌家族病史；
⑤有肠息肉的患者；
⑥大肠癌手术后的患者。收集其新鲜粪便标本置-20℃保存备用。本研究经医院伦理委员会讨论通过，所有患者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器 NDRG4 和SDC2 基因甲基化检测试剂购自人和未来生物科技（长沙）有限公司，癌胚抗原（carcinoembryonicantigen，CEA）检测试剂购自苏州丰泰医疗用品贸易有限公司，糖类抗原19－9（carbohydrateantigen199，CA19-9）检测试剂购自北京健安生物科技有限公司，DJE-9 基础电泳仪购自北京中慧天诚科技有限公司，C1000TMPCR 仪、GelDocTM EZSystemDE 等购自BIO-RAD 公司，全自动电化学发光免疫分析仪（GBI-MAP800）购自武汉华大基因生物医学工程有限公司，QIAampDNAStoolMiniKit（51604）、EpiTectBisulfiteKits（59104）等购自德国Qiagen 公司，Premix Taq（Ex Taq Version 2.0 plus dye）和TaKaRaEpiTaqTMHS（forbisulfite-treatedDNA）等购自Takara 公司，引物由引物由人和未来生物科技（长沙）有限公司合成。

1.3 检测方法

1.3.1 甲基化NDRG4 和SDC2 检测 每个受检者领取一份粪便收集盒，受检者在医院按要求取5g 粪便放入粪便收集盒。严格按照试剂说明书进行检测，使用粪便DNA 提取试剂盒从粪便样本中提取基因组DNA，使用亚硫酸氢盐转化试剂盒将基因组DNA 进行修饰，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；
随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过计算NDRG4、SDC2 基因与内标基因ACTB 的扩增Ct 比差值是否在判定临界值内，判断甲基化水平。

1.3.2 肿瘤标志物检测 受检者均采取空腹静脉血3mL，进行离心处理，3800r／min，离心5min，血清CEA、CA19-9 采用全自动电化学发光免疫分析仪以及试剂为仪器配套试剂。正常参考值为：CEA ≤5ng／mL，CA19-9 ≤35U／mL。

1.4 结果判断 本试剂盒的阳性判断值为：当内标基因ACTB 检测Ct 值≤37 时，SDC 检测Ct 值≤41.64 或NDRG4 检测Ct 值≤36.07，检测结果为阳性；
当内标基因ACTB 检测Ct 值≤37 时，SDC2 检测CT 值>41.64 或无CT 值，且NDRG4 检测CT 值>36.07 或无CT 值，检测结果判定为阴性；
当内标基因ACTB 检测Ct 值>37或无CT 值时，检测结果无效，需重新检测。

1.5 统计学方法采用 用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析。计数资料以百分比表示，采用χ2检验，采用ROC 曲线来评判灵敏度及特异度，当P<0.05 为差异有统计学意义。

2.1 粪便SDC2 基因甲基化水平分析 表1 示，结直肠癌术后化疗组、结直肠息肉组和结直肠癌组粪便SDC2 基因甲基化阳性检出率差异有统计学意义，χ2=25.433，P<0.001，组间比较发现，结直肠癌组SDC2基因甲基化阳性检出率高于结直肠癌术后化疗组、结直肠息肉组，差异有统计学意义。NDRG4 基因甲基化水平分析表2 示，结直肠癌术后化疗组、结直肠息肉组和结直肠癌组粪便NDRG4 基因甲基化阳性检出率差异有统计学意义，χ2=8.983，P<0.05，组间比较发现，结直肠癌组NDRG4 基因甲基化阳性检出率高于结直肠癌术后化疗组、结直肠息肉组，差异有统计学意义。SDC2/NDRG4 基因甲基化水平分析表3 示，结直肠癌术后化疗组、结直肠息肉组和结直肠癌组粪便SDC2/NDRG4 基因甲基化阳性检出率差异有统计学意义，χ2=25.433，P<0.001，组间比较发现，结直肠癌组SDC2/NDRG4 基因甲基化阳性检出率高于结直肠癌术后化疗组、结直肠息肉组，差异有统计学意义。

表1 各组患者粪便SDC2甲基化检测结果比较

表2 各组患者粪便NDRG4甲基化检测结果比较

表3 各组患者粪便SDC2、NDRG4甲基化检测结果比较

2.2 血清肿瘤标志物水平分析 表4 示，结直肠癌术后化疗组、结直肠息肉组和结直肠癌CA19-9 阳性检出率差异无统计学意义。表5 示，结直肠癌术后化疗组、结直肠息肉组和结直肠癌CEA 阳性检出率差异有统计学意义，χ2＝13.411，P<0.05。组间比较显示，结直肠癌组CEA 阳性检出率高于结直肠癌术后化疗组、结直肠息肉组，差异有统计学意义。表6 示，结直肠癌术后化疗组、结直肠息肉组和结直肠癌CA19-9/CEA 阳性检出率差异有统计学意义，χ2=14.129，P<0.05。组间比较显示，结直肠癌组CA19-9/CEA 阳性检出率高于结直肠癌术后化疗组、结直肠息肉组，差异有统计学意义。

表4 各组患者血清肿瘤标志物CA19-9检测结果比较

表5 各组患者血清肿瘤标志物CEA检测结果比较

表6 3组患者血清肿瘤标志物CEA/CA19-9检测结果比较

2.3 粪便基因甲基化及血清肿瘤标志物曲线下面积分析 SDC2/ NDRG4、NDRG4、SDC2 基因甲基化检测特异度高于CEA、CA19-9、CEA/CA19-9，NDRG4 特异度最高。SDC2/ NDRG4、SDC2 基因甲基化检测灵敏度高于NDRG4、CEA、CA19-9、CEA/CA19-9。SDC2/NDRG4，SDC2 检测阳性预测值及阴性预测值最高。分析ROCAUC 示，SDC2 和NDRG4 甲基化联合检测最高，其次为SDC2 基因检测。

表7 结直肠癌患者粪便SDC2、NDRG4、SDC2/NDRG4及CEA/CA19-9检测效果比较

图1 3组受试者的SDC2甲基化（45-Ct）

图2 3组受试者的NDRG4甲基化（45-Ct）

根据IARC 发布的2020 年全球最新癌症统计数据显示，直肠癌新发病例数和死亡病例数分别位于所有恶性肿瘤的第三位和第二位。目前结肠镜是早期发现肠癌的最重要的检查，其敏感度及特异度最好，但是结肠镜作为侵入性检查，检查过程中要求患者做肠道准备及存在暴露隐私等缺点，使其难以广泛应用于筛查。还有一些检测方法如粪便隐血试验、直肠指检、肿瘤标记物检测、结肠CT 等，均存在不同程度的敏感度低及特异度不高的缺点。CEA、CA19-9 等血清学肿瘤标志物是CRC 临床辅助诊断和预后判断中常见的方式，但特异性不高，使其在临床诊断的应用中价值不高。SDC2 、NDRG4 基因甲基化是CRC 重要的生物学特征［13-16］，因此通过分析粪便中游离DNA 甲基化的状况可以进行有效的结直肠癌筛查。在粪便样本中检测特定基因的DNA 甲基化是实现结直肠癌检测的一种有潜力的选择［17-18］，近来发布的直肠癌筛查指南中提出要将粪便DNA 检测作为理想的筛查技术。DNA 甲基化是表观遗传学的主要范畴，可以通过各种机制来影响不同基因的表达，在结直肠癌的形成和发展过程中有着重要意义［19-21］。本研究结果显示，结直肠癌组粪便基因SDC2 、NDRG4 阳性检出率显著高于结直肠癌术后化疗组、直肠息肉组，说明粪便基因SDC2 、NDRG4甲基化检测可作为结直肠癌患者筛查的有效指标；
结直肠癌组阳性检出率显著高于术后化疗组，说明粪便基因SDC2 、NDRG4 甲基化检测不仅有助于结直肠癌手术效果的评价，还能用于监测疾病的复发。粪便基因SDC2/ NDRG4、NDRG4、SD2 甲基化检测特异度高于CEA、CA19-9、CEA/CA19-9。SDC2/ NDRG4，SDC2 检测阳性预测值及阴性预测值最高。同样根据ROCAUC分析显示，SDC2 和NDRG4 甲基化联合检测最高，说明SDC2 、NDRG4 甲基化联合检测可作为CRC 筛查的有效指标。联合粪便基因SDC2 、NDRG4 甲基化检测优于CEA 联合CA19-9 的诊断效能。粪便基因SDC2 、NDRG4 甲基化检测有助于CRC 患者的筛查及预后，对于指导临床诊疗工作有重大意义。由于该研究中样本量有限，要进一步证实SDC2 、NDRG4 甲基化水平与结直肠癌发展及预后的关联性还需要开展更多大样本研究。

图3 NDRG4、SDC2及由Logistic回归所得预测概率P的ROC曲线

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