棉花根际溶磷菌WJP-7发酵培养基优化及防病增产效果

王 宁,史应武,牛新湘,杨红梅,楚 敏,詹发强,包慧芳,杨 蓉,龙宣杞,丁荣荣

(1.新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物实验室,乌鲁木齐 830091;2.农业农村部西北绿洲农业环境重点实验室,乌鲁木齐 830091;3.新疆农业科学院土壤肥料与农业节水研究所,乌鲁木齐 830091; 4.新疆生产建设兵团第七师农业科学研究所,新疆奎屯 833200)

【研究意义】棉花在我国经济中占有十分重要的地位[1]。新疆已发展为我国最大棉花种植基地及优质棉生产基地[2]。2021年我国棉花种植面积302.81×104hm2(4 542.15×104亩) ,棉花总产量573.1×104t,其中新疆地区棉花种植面积为250.61× 104hm2(3 759.15×104亩),棉花产量为512.9×104t,占全国棉花总产量的89.50%[3]。新疆地区降水少、蒸发大,棉田土壤盐渍化问题较突出[4]。黄萎病(VerticilliumdahliaKleb．)是新疆棉花生产中重要病害之一[5]。盐渍化土壤普遍含有较高浓度的盐离子,会限制棉花对土壤中其他营养元素的吸收[6]。磷素是植物生长所需的第二大元素,而溶磷微生物能够有效转化盐渍化土壤中难溶磷,提高磷肥利用率、促进作物增产、提高抗病力,减轻土壤对化学肥料的依赖[7]。溶磷菌能够抑制棉田土壤病原菌的生长、降低棉花病害的作用,对于棉花产业的健康发展有十分重要的意义。【前人研究进展】根据溶磷微生物作用底物的不同,溶磷菌可分为有机磷分解菌和无机磷分解菌,部分菌种又同时具有溶解有机磷和无机磷作用[8,9]。环境因素、土壤类型、土壤理化性状、人为干扰等因素影响溶磷菌在土壤中的数量和种类。细菌、真菌和放线菌中都能筛选出具备溶磷功能的菌种,目前报道的细菌种属主要包括假单胞菌(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、黄杆菌属(Flavobacterium)等。利用农田特有生境下的溶磷菌生产菌肥,利于有益菌在作物根部定殖,原位分离是筛选有益微生物的重要来源[10]。有机磷降解枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)通过分泌抑菌物质抑制棉花黄萎菌生长繁殖[11]。溶磷枯草芽孢杆菌包衣玉米种子,能够显著抑制红粉镰刀菌(Fusariumroseam)的生长,从而防治玉米苗腐病发生[12]。通过22种土壤固氮或解磷细菌对茄黄萎病菌(Verticilliumdahliae)、棉花立枯病菌(Rhizoctoniasolani)和黄瓜角斑病菌(Pseudomonassyringae)等9种植物病菌平皿抑菌实验,2株溶磷菌表现出很强的抑菌防病效果[13]。溶磷菌产生吲哚乙酸(IAA),可影响病原菌与植物之间相互作用[14]。【本研究切入点】溶磷微生物田间应用效果受诸多因素的影响,其中发酵培养基组成是影响溶磷菌施用效果的重要因素。探索台湾假单胞菌(Pseudomonastaiwanensis)液体发酵增菌的研究较少。正交试验能解决发酵培养基选优问题[15-18],但针对台湾假单胞菌发酵条件研究鲜有报道。【拟解决的关键问题】从新疆棉田分离出1株高效无机磷分解菌(Pseudomonastaiwanensis) WJP-7,采用正交设计试验研究菌株WJP-7培养基对发酵效果的影响,挖掘台湾假单胞菌WJP-7的施用价值,分析培养基组成对WJP-7发酵效果的影响,得出WJP-7液体发酵最佳发酵工艺,为研究WJP-7菌的增菌条件及田间应用效果评价提供理论指导。

1.1 材 料

1.1.1 菌种与菌剂

2020年4～10月在胡杨河市130团 8连试验地开展。前茬为棉花,面积约 9 hm2。土壤养分:有机质含量13.2 g/kg,碱解氮63.25 mg/kg,速效磷12.4 mg/kg,速效钾410.2 mg/kg,pH值 7.01。4月15日整地,基施尿素 14 kg/667m2,磷酸二铵 13 kg/667m2,硫酸钾 4 kg/667m2。4月20日播种,种植不抗病的新陆早16号检验菌肥的效果。试验区田间管理、病虫害防治与对照相同。4月20日播种,4月25日滴出苗水。全生育期浇水10 次,5月29日第1次滴头水,每隔7～10 d滴1次水。其他栽培管理同大田生产相同。

P.taiwanensisWJP-7 由新疆特殊环境微生物重点实验室前期自行筛选。

65×108/mL芽孢杆菌可湿性粉剂,实验室中试产品。

1.1.2 培养基

1.1.2.1 NA培养基

液体NA培养基用于菌种的活化,固体NA培养基用于活菌计数与保藏。

1.1.2.2 假单胞菌初始培养基

蛋白胨0.5%、MgCl20.5%、K2SO40.07%,pH 7.0,灭菌121℃,20min。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

采用随机排列,共设3个处理,处理1(T1):滴施“30×108CFU/mL WJP-7水剂”5.0 kg/667m2;处理2(T2):滴施“65×108CFU/g芽孢杆菌可湿性粉剂”2.0 kg/667m2;处理3(CK):对照,滴施清水。每个处理面积1 hm2,重复3次。在棉花头水(5月29日)滴施,每次施用时先滴清水,膜边行见水湿透后,再把2种菌剂加入到施肥罐中滴施 0.5 h左右,滴水量约30 m3。

1.2.2 测定指标

采用五点取样法,选择试验区代表性5个取样点,每个点连续调查300株棉花,在花期和吐絮期调查棉花黄萎病发病株数。病情分级参照国家标准(GB/T 22101.5-2009)中5级分级法,计算发病株率和病情指数。棉花黄萎病分级标准[8-11]:0级,健株;1级,病株叶片有25%以下叶片显症;2级,病株叶片有25%～50%表现病状;3级,病株叶片有50%以上叶片显症;4级,全株叶片发病,干枯脱落成光秆或急性萎蔫死亡。

病情指数=∑(级值×株数)/(最高级值×总株数)×100;防治效果(%)=(对照病情指数-处理病情指数) /对照病情指数×100。每个处理选择有代表性样点5个,每点标记棉株20株,棉花收获期时调查各处理收获株数,标记棉株上成铃数,测定平均单铃重,计算产量。

1.2.3 菌株摇瓶增菌工艺正交优化

将台湾假单胞菌WJP-7菌种划线接种于营养琼脂平皿,28℃倒置培养24 h,挑取典型菌落接种于液体假单胞菌初始培养基,28℃摇床震荡培养 18～20 h,作为种子液。在初始培养基的基础上选择蛋白胨、MgCl2、K2SO4为主要试验因素,设计L9(34)三因素三水平正交试验,优化假单胞菌WJP-7菌株的摇瓶增菌工艺条件。正交试验将WJP-7种子液接种到三角瓶,在温度28℃、初始 pH 7.0、接种量1%、转速180 r/min,摇床恒温震荡培养 12 h,测定OD600值,比较不同发酵培养基组成对台湾假单胞菌WJP-7生长的影响。表1

表1 因素水平

1.2.4 最优条件发酵验证

参照菌株摇瓶增菌工艺正交优化试验得到的最佳增菌发酵培养基,采用摇瓶液体培养WJP-7菌株,在接种量1%、转速180 r/min,温度28℃、初始 pH 7.0、摇床恒温培养20 h,收获菌液,测定OD600值,验证正交试验增菌结果。

1.3 数据处理

通过 SPSS Statistics 26.0 软件进行数据处理和统计分析。

2.1 WJP-7菌株摇瓶增菌工艺正交优化

研究表明,台湾假单胞菌WJP-7发酵培养基中9号条件下发酵培养菌液浓度最高,3种发酵培养参数对台湾假单胞菌培养浓度的影响顺序为蛋白胨>MgCl2>K2SO4,发酵培养条件最优组合为A3B3C2。表2

表2 L9(34)正交试验

3个试验因素中,第一个即蛋白胨添加量的P值为0.002,小于判错临界概率0.005,而MgCl2、K2SO4含量的添加P值分别为0.140、0.412,大于0.05。蛋白胨含量对试验指标有显著影响,各因素的最优水平为A3B3C2,最佳WJP-7菌株培养基配方为蛋白胨20 g/L,氯化镁15 g/L,硫酸钾1.4 g/L。表3,图1

表3 方差分析

图1 三试验因素与菌体浓度趋势

2.2 验证试验

研究表明,与初始发酵培养基相比,优化后假单胞菌WJP-7活菌数在8 h后达到稳定的平台期,20 h活菌数高达3.60×109CFU/mL。发酵稳定期活菌数有显著性差异(P<0.05)。图2

图2 增菌培养基的优化

2.3 菌剂田间试验

2.3.1 不同处理对棉花黄萎病的防治效果

研究表明,不同处理黄萎病病情指数分别为2.51、1.12和 4.52,其中65×108CFU/g枯草芽胞杆菌可湿性粉剂处理的棉花黄萎病病情指数最低,30×108CFU/mL WJP-7水剂和65×108CFU/g枯草芽胞杆菌可湿性粉剂处理对花期黄萎病防效分别为44.57%和75.22%,絮期防治效果分别为50.53%和60.82%。表4

表4 不同处理对棉花黄萎病的防治效果比较

2.3.2 不同处理对棉田土壤理化性质的影响

研究表明,施用2种微生物菌剂分别显著提高了棉田土壤碱解氮、有效磷和速效钾含量14.45%、45.40%、9.70%和19.44%、25.26%、10.02%(P<0.05),可显著提高土壤pH值;而施用微生物菌剂对棉田土壤除全氮的含量增加不显著外(P>0.05),对其它养分和pH值均有显著影响(P<0.05)。表5

表5 不同菌剂下棉田土壤理化性质变化

2.3.3 不同处理对棉花产量构成因子及产量的影响

研究表明,棉花滴施30×108CFU/mL WJP-7水剂和65×108CFU/g枯草芽胞杆菌可湿性粉剂后收获株数比对照增加700株/667m2和800株/667m2,单株铃数增加0.15和0.21个,对单铃重影响较小,产量增加54.86和74.64 kg/667m2,增产率为14.35%和19.51%,其中65×108CFU/g枯草芽胞杆菌可湿性粉剂增产效果最明显。表6

表6 不同处理下棉花产量性状变化

3.1如何将土壤中作物不可利用的无效磷转换成可吸收的溶解态磷,是提高作物对磷元素摄取的关键[19]。李凌凌等[20]从车前草根际中分离到P.taiwanensisP2菌株,经优化后其溶解磷酸三钙的最大溶磷量为优化前的1.43倍。Nandre VS等[21]证明P.taiwanensis能改变磷酸盐的溶解状态是因为产生铁载体,铁载体对磷酸盐的循环利用起重要作用。Chaudhary P等[22]的试验表明P.taiwanensis与纳米石膏联合使用不仅活化土壤元素,还可以显著提高土壤酶活,帮助植物构建更为健康的根系微生态环境。对分离自棉花根际的P.taiwanensisWJP-7进行增菌工艺研究,确定其最佳发酵培养基为蛋白胨20 g/L,氯化镁15 g/L,硫酸钾1.4 g/L,为其商品化应用奠定了基础。

3.2细菌发酵是一个利用细菌的特殊代谢途径,受复杂动态及多因素影响地转化原料为目标产物的生物化学过程[23, 24]。细菌发酵分为厌氧和好养两种,发酵方式很多,种类繁多,产物丰富,应用广阔。假单胞菌生长繁殖能力不仅取决于菌种性能,也受细菌发酵条件如培养基成分、温度、初始pH、接种量、溶氧等的影响。适宜的发酵条件加速假单胞菌生长繁殖,关系到发酵的成败。培养基、初始 pH值、培养温度和发酵时间等对假单胞菌发酵的影响极大,互相作用,互相影响[25, 26],高产发酵需要各因素之间的最佳配合,尤其是培养基配方一定要科学合理。

3.3目前,国内生防微生物细菌等发酵条件的优化多采用正交试验[27-29],考虑培养基及其交互作用的报道较少。正交试验研究表明,最优培养基配方确定为蛋白胨20 g/L,氯化镁15 g/L,硫酸钾1.4 g/L。初始 pH 7.0、发酵温度 28℃、发酵时间20 h,活菌数最高。微生物发酵液具备安全、无污染、易降解等。在发酵过程中,WJP-7菌株可能分泌水解酶,利用发酵培养基中的蛋白质大分子有机物,产生促生物质IAA及抑菌物质。

正交试验优化了台湾假单胞菌WJP-7摇瓶发酵培养基,培养基配方为蛋白胨 20 g/L,MgCl215 g/L,K2SO41.4 g/L,活菌数达到3.6×109CFU/mL。摇瓶增菌发酵最优培养基发酵验证试验最高活菌数高达3.60×109CFU/mL。菌株WJP-7水剂处理对棉花黄萎病防治效果为50.53%,对棉田土壤除全氮含量不显著外,对其它养分和pH值均显著影响(P<0.05),增产率为14.35%,具有明显的增产效果。

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