不同的细胞保存液对自然杀伤细胞和自然杀伤T细胞短期保存的影响

仇欣霞，张丽华，陈荷，董为人*

（1.南方医科大学实验管理中心，国家级医学基础实验教学示范中心，国家级医学形态学虚拟仿真实验教学中心，广东 广州 510515；
2.佛山科学技术学院医学院；
3.南方医科大学第三附属医院神经外科）

随着免疫细胞生物学的快速发展，免疫治疗已成为肿瘤治疗的重要手段之一。细胞免疫治疗疗法，又称为过继免疫治疗，是采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成千倍增多，靶向性杀伤功能增强，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力［1-2］。用于细胞免疫治疗疗法的免疫细胞主要有自然杀伤细胞（natural killer cell，NK 细胞）［3］、自然杀伤T细胞（natural killer T cell，NKT细胞）［4］等。细胞收集后，需要用保存液重悬再由实验室转运到临床。因自体免疫细胞治疗是个体化治疗，细胞制品与普通的生物制品和药品不同，如何在运输过程中保持免疫细胞的最大活性及其原有生物学性质，确保最终应用于治疗的细胞达到统一的质量标准成为了免疫治疗的关键。因此本研究探讨4 ℃条件下短时间内3种不同的保存液对免疫细胞保存的影响，为免疫细胞治疗前细胞保存的标准化、统一性、科学性提供一定的实验依据。

1.1 材料 实验所用外周血均采自于课题组健康志愿者，血液标本4项传染病检测及血常规和凝血功能正常。根据国务院《医疗机构管理条例》规定，志愿者对实验知情同意。人慢性髓原白血病K-562细胞由本实验室提供。生理盐水（四川科伦药业公司），人血白蛋白（human serum albumin，HSA）（西班牙GRIFOLS 公司），低分子右旋糖苷注射液（广东雷允上药业公司），NKT细胞培养基（瑞士Lonza 公司），Lymactin-NK 抗体及NK 细胞培养基（珠海贝索生物技术有限公司）。IL-2（北京双鹭药业股份有限公司），IL-21、IL-15（上海泽叶生物科技有限公司），OKT3及标记抗体CD3、CD56、CD16（美国BD 公司）。BD Accuri C6 流式细胞仪、3111 型细胞培养箱、ST40 大容量离心机（美国Thermo 公司），Countstar Biotech 细胞计数仪（上海睿钰生物科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 NK 和NKT 细胞培养 抽取4位志愿者外周血各40 ml，经Ficoll 淋巴细胞分离液分离得到外周血单个核细胞，均分成2 份。分别按照NK 细胞、NKT 细胞培养方案进行培养。接种于T25 的培养瓶内，一份加入IL-2 和Lymactin-NK 抗体诱导成NK 细胞，一份加入IL-21、OKT3、IL-15、IL-2 抗体诱导成NKT 细胞，并用培养基调整细胞密度为3×106/ml。参考文献［5-6］及前期预实验结果，每天观察细胞，根据细胞生长状况，以后每2～3 d适当补充细胞因子及淋巴细胞培养基，控制细胞密度在（1～2）×106/ml，根据培养情况转移至细胞袋培养。

1.2.2 NK 和NKT 细胞收集及分组保存 按照NK和NKT 细胞的培养方法分别培养细胞直至11 d 以上。然后将细胞充分混匀，计数。待细胞总量达到6×108以上时，停止培养，收集细胞。根据免疫细胞回输浓度，将培养好的8 份免疫细胞（NK 细胞4份、NKT细胞4份）分别收集并应用生理盐水（保存液A）、生理盐水+5%HSA（保存液B）、生理盐水+5%HSA+1%低分子右旋糖苷（保存液C）3 种保存液在4 ℃条件下保存，装入转移袋内，每份保存液体积为50 ml。在细胞存放0、6、12、24 h时分别进行细胞活率、结团率、流式细胞术及杀伤性检测。

1.2.3 不同保存液中的细胞活率及结团率检测在细胞存放0、6、12 和24 h 时，将保存液中的细胞充分混匀；
取1 ml细胞悬液，按细胞悬液∶0.2%台盼蓝（v∶v）＝1∶1 的比例充分混匀。取20 μl细胞混匀液加入细胞计数板中，用Countstar 细胞计数仪进行细胞活率及结团率检测，重复3次。

1.2.4 不同保存液中细胞的流式细胞术检测 在细胞存放0、6、12 和24 h 时，将培养细胞充分混匀，取细胞悬液5 ml，调整细胞密度为1×106/ml，分别取CD3、CD56 的单克隆抗体各2 μl，加入细胞悬液500 μl，室温下避光孵育20 min，同时设立空白同型对照，1 500 r/min 离心5 min，弃上清，生理盐水洗涤2 遍后，用200 目筛网过滤细胞样品重悬上机检测。

1.2.5 K-562 细胞的培养 复苏K-562 细胞株，转移至加有RPMI-1640 培养基＋10%胎牛血清的培养基中，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中扩增培养待用。

1.2.6 杀伤实验 在细胞存放0、6、12 和24 h 时将培养细胞充分混匀作为效应细胞，K-562细胞作为靶细胞。实验分效应细胞+靶细胞组、效应细胞组、靶细胞组，每组3 个复孔。取对数生长期的K-562 细胞，调整其浓度为2×105/ml。将NK、NKT 的细胞浓度调整为2×106/ml，按照效靶比为10∶1 的比例加入96 孔板中。96 孔板中，效应细胞+靶细胞组每孔加效应细胞、K-562 细胞各100 μl；
靶细胞组每孔加入K-562 细胞、RPMI-1640 培养液各100 μl；
效应细胞组每孔加入效应细胞、RPMI-1640 培养液各100 μl。置于培养箱中培养24 h，然后每孔加入CCK-8 试剂10 μl，37 ℃孵育4 h，全自动酶标仪（波长490 nm）检测光密度，计算杀伤率。杀伤率=［1-（效应细胞加靶细胞孔吸光度值-效应细胞孔吸光度值）/靶细胞孔吸光度值］×100%。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0 软件进行统计学分析，正态分布计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用重复测量的方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.1 不同保存液中的细胞活率及结团率检测 存放至12 h 时，NK 细胞及NKT 细胞的A 组保存液中的细胞活率低于85%，与其他2组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；
存放至24 h 时，各组细胞活率均低于85%，但A 组保存液中的细胞活率明显低于B、C 组（P＜0.05）。存放12、24 h 时，B组和C 组保存液中细胞结团率均低于A 组，且存放24 h 时，C 组的结团率低于B 组（P＜0.05）。见图1。

图1 NK细胞和NKT细胞在3种保存液中存放不同时间后的活率及结团率的统计分析图

2.2 不同保存液中细胞的流式细胞术检测 将各组保存液中的NK 细胞和NKT 细胞在0、6、12 和24 h 时分别进行细胞表面标记抗原流式鉴定。结果分别与0 h比较，各组各时间点的细胞表面标记均未出现明显变化（P＞0.05）。见图2及表1、2。

表1 各时间点NK细胞表面标记的流式结果变化（，%）

表1 各时间点NK细胞表面标记的流式结果变化（，%）

图2 NK细胞和NKT细胞在3种保存液中存放不同时间的流式细胞图

表2 各时间点NKT细胞表面标记的流式结果变化（，%）

表2 各时间点NKT细胞表面标记的流式结果变化（，%）

2.3 不同保存液中的细胞杀伤实验 杀伤实验结果显示，无论是NK细胞还是NKT细胞，存放24 h时，各组细胞杀伤力与0 h 比较，均出现明显下降（P＜0.05）。存放12 h 时NK 细胞和NKT 细胞的A组细胞与C 组比较，杀伤作用明显减弱（P＜0.05）；
存放24 h时NK细胞、NKT细胞的A组、B组与C 组相比杀伤力下降更明显（P＜0.05）。见图3。

图3 各组NK细胞、NKT细胞杀伤力检测统计图

从2011 年美国洛克菲勒大学教授Ralph M.Steinman 因“发现树突状细胞及其在获得性免疫中的作用”［7-8］而获得诺贝生理学或医学奖到2013年Science 杂志把肿瘤免疫治疗列为年度重大科学突破［9］，再到发现以PD1 为核心药物的免疫检查点抑制剂疗效更显著［10］，世界范围内已经掀起了开发免疫疗法的热潮，免疫治疗已成为肿瘤治疗最具价值和潜力的治疗手段［11］。

NK 细胞是机体重要的天然免疫细胞，占外周血淋巴细胞的比例约10%～20%。它不仅参与免疫调节，也与抗肿瘤密切相关［12］。近年来，越来越多的研究证明了NK 细胞加入了抗癌行列［13］。NKT 细胞是体内重要的执行免疫调节功能的特殊的T 淋巴细胞亚群，通过分泌细胞因子来调节免疫系统的功能。因此在体外得到高增殖活性的NK和NKT 细胞，然后回输给免疫系统功能低下的机体，可增强体内免疫监视和清除功能，提高机体抗衰老的能力，降低疾病风险［14-15］。

无论临床应用哪种免疫细胞治疗疾病，都必须遵循《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）》，为临床免疫细胞治疗提供安全有效的细胞产品［16］。随着肿瘤免疫细胞治疗的飞速发展，细胞进行短时内的保存和运输势必会越来越频繁。如何最大限度保证短期内保存袋内的细胞生物学特性不发生变化是许多实验室人员的探索目标。这其中包括保存液的成分、保存的时间和温度等。已有大量实验证明，无论是免疫细胞还是干细胞，在4 ℃恒温条件细胞状态最好［17-19］。因此本实验主要研究在4 ℃条件下不同的保存液成分对NK 细胞和NKT 细胞短期保存的影响。因为生理盐水的渗透压值和正常人的血浆、组织液都是大致一样的，所以我们将它用作保存液的主要成分。本研究结果发现，仅仅使用生理盐水做保存液的A 组，在保存12 h 时细胞就出现明显结团，活率下降，杀伤力也随之下降。随着时间延长，细胞内产生自由基，发生氧化反应，从而引起细胞间及细胞与容器间发生黏附，结团率上升［20］。在B 组保存液中，加入HSA。HSA 是从健康的人体血浆中分离提取的，经一定温度和时间处理灭活后得到，目前在临床上经常用于休克、颅内压升高及低蛋白血症等。除此以外，研究还发现HSA 在细胞保存中能起到防止细胞结团和维持细胞膜稳定性的作用，同时还能维持细胞液渗透压的稳定［21-22］。本研究结果发现，B组和C组细胞在12 h细胞结团率较低。低分子右旋糖酐，通常为血容量扩充剂，给予它可以提高血浆胶体渗透压，增加血容量，减低血小板黏附性并抑制红细胞凝聚，改善微循环能力等［23］。为了降低细胞结团率，C 组联合使用HSA 和低分子右旋糖苷，到24 h 时此组的细胞结团率较低，与其他2 组比较差异有统计学意义，活率和细胞杀伤力相对较高，而且这保存液配制方法也很简便易得，适合免疫细胞的临床保存和运输使用。

本实验通过对不同保存液中NK 细胞和NKT细胞在4 ℃条件下短期保存的活率、结团率及杀伤力等方面影响的探讨，发现NK 细胞和NKT 细胞在生理盐水+5%HSA+1%低分子右旋糖苷保存液中存放效果最佳，但也不应超过24 h。此次实验初步为免疫细胞保存的科学性、标准化做了探索并提供了科研依据。

猜你喜欢靶细胞活率生理盐水感冒了多睡觉，真的有用吗新传奇(2022年51期)2023-01-04两种肉用品种种公羊采精量及精子活率的比较分析草食家畜(2022年6期)2022-12-27双色法和三色法检测NK细胞杀伤功能的实用性比较分子诊断与治疗杂志(2022年11期)2022-12-23Physiological Saline疯狂英语·初中天地(2022年5期)2022-07-06生理盐水疯狂英语·初中版(2022年5期)2022-05-11稀释方法、孵育温度和时间对冷冻-解冻后猪精液质量的影响家畜生态学报(2021年7期)2021-07-28流式细胞术检测NK细胞的细胞毒作用的两种方法比较①中国免疫学杂志(2019年3期)2019-03-13高中生关于肿瘤基因治疗前景及方法的学习与思考神州·中旬刊(2019年1期)2019-02-12自制生理盐水中学生数理化·八年级物理人教版(2018年5期)2018-06-21卵黄和十二烷基硫酸钠添加量对犬精子冻后活率的影响兽医导刊(2016年14期)2016-09-05