脊髓背角UCP4调节线粒体膜电位参与神经病理性痛机制研究

吴菲菲，黄云强，夏雨露，刘勃志，张昆龙，郑 杰，拜云虎，朱昌磊，杨雁灵，王亚云(空军军医大学：基础医学院教学实验中心，西京医院康复理疗科，西京医院肝胆胰脾外科，陕西 西安 700)

近20年来，神经病理性痛(neuropathic pain，NP)已成为最常见和最严重的临床慢性症状[1]。一项流行病学研究揭示NP的患病率为6.9%～10.0%，并呈逐年上升趋势[2]，严重影响了患者的生活质量。NP发病机制复杂，治疗效果较差，发病机制尚未完全阐明。目前临床治疗中使用的阿片类药物和非甾体抗炎药仅对少数患者有效，因此，进一步研究其发生发展机制对于研发新的治疗药物，改善临床治疗效果具有重要意义。脊髓背角作为疼痛信息整合的初级中枢，外周损伤可能引起抑制性背角神经元的功能障碍，导致投射神经元的敏化和兴奋性的增加[3]，可作为研究NP的主要突破口。

线粒体作为中枢神经系统供能的重要细胞器[4]，在疼痛的发生发展中发挥重要作用。线粒体解偶联蛋白4(uncoupling protein 4，UCP4)定位于线粒体内膜，是一种介导H+内流的跨膜蛋白质，介导质子重新进入线粒体基质，使得流经ATP合酶的质子减少，进而降低合成ATP的驱动力，即形成“质子漏”[5]。作者前期研究发现，NP状态下脊髓背角UCP4表达量降低，提示UCP4可能参与NP的中枢敏化过程并发挥重要作用[6]，但是其镇痛作用和机制不清。本文在此基础上进行深入研究，旨在阐明UCP4参与NP中枢敏化过程的机制。首先使用立体定位仪在脊髓背角注射病毒，靶向调控脊髓背角UCP4的表达，然后构建坐骨神经选择性损伤(spared nerve injury，SNI)模型，模拟NP，通过检测机械性痛敏、热痛敏、线粒体超微结构、线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)及腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)含量等指标变化，阐明UCP4参与NP的作用机制，为研究NP提供新的分子靶标，为治疗NP和开发镇痛新药提供理论依据。

1.1 材料

采用8～10周龄的健康雄性C57BL/6J小鼠45只，体质量20～25 g，由空军军医大学实验动物中心提供。本实验全部方法和操作遵守国际疼痛研究协会指南进行。RNA提取试剂盒(DP451)购自天根生化科技(北京)有限公司；
MMP检测试剂盒(C2006)、SOD检测试剂盒(S0101S)、总谷胱甘肽检测试剂盒(S0052)均购自上海碧云天生物技术有限公司；
UCP4的AAV病毒购自和元生物技术(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 脊髓背角定位注射病毒 将UCP4过表达和干扰AAV病毒分别定位注射到小鼠的脊髓背角中。小鼠使用水合氯醛麻醉，切除L5-L6椎体上方的棘旁肌，并对靶侧椎体进行椎板部分切除术。使用微量注射器(79013，深圳市瑞沃德生命科技有限公司，中国)注射，注射量为300 nL，注射速度为50 nL/min，注射坐标为X轴500 nm，Z轴300 nm。注射完成后，留置10～15 min后取出注射器。

1.2.2 NP模型的建立 SNI模型的制备按照DECOSTERD等[7]的方法：将小鼠用420 mmol/L水合氯醛腹腔麻醉；
分离右后肢股二头肌，暴露并双重结扎胫神经和腓总神经，剪断结扎的2～4 mm的神经干。假手术组只暴露坐骨神经干及其分支而不切断，其余过程同手术组。

1.2.3 行为学检测 机械痛检测参照DIXON[8]的方法。首先将小鼠置于金属网上的透明玻璃罩内，适应30 min；
然后用不同压力的纤维丝(从小到大)垂直刺激足底2、3跖趾间皮肤敏感处，观察是否出现缩足反应，每次刺激间隔5 s，连续 10次，诱发4～6次缩足反应视为50%的反应率，其压力值即为阈值。热板痛检测按HARGREAVES等[9]方法。先将小鼠放在热板仪(YLS-6B)上适应5 min，温度调整为(52.0±0.5)℃。记录小鼠右后足手术侧第一次出现舔、退缩或跳跃等反应的时间，每次时间不超过30 s，同一只小鼠检测时间间隔5 min。

1.2.4 RT-PCR 收集小鼠脊髓腰膨大组织，使用RNA提取试剂盒提取总RNA，反转录后进行RT-PCR。UCP4上游引物：CTCAGAGCCAACCGAATAGC；
下游引物：GGCTGACAGATGCAACAGAA；
内参为β-actin(擎科，西安)。

1.2.5 蛋白水平检测 提取小鼠脊髓腰膨大组织的蛋白，采用BCA法蛋白定量，SDS-PAGE电泳后，孵育多克隆兔抗β-actin(1 ∶5 000)，鼠抗UCP4(1 ∶1 000)，4 ℃过夜孵育；
次日加入HRP标记的抗兔、抗鼠IgG二抗(1 ∶5 000)，加入ECL液发光检测并拍照保存数据。以β-actin为内参进行半定量分析。

1.2.6 线粒体功能指标检测(MMP/SOD/GSH/ATP)按照生产厂商说明书，将脊髓背角组织匀浆，依次检测SOD酶活性、GSH含量及ATP的含量。MMP检测：制备脊髓背角单细胞悬液，负载染料JC-1，37 ℃避光孵育30 min，贝克曼流式细胞仪检测，激发波长488 nm，发射波长535 nm。

1.2.7 透射电镜分析 腹腔注射麻醉小鼠，制样，在JEM-1200EX型透射电镜80 kV下观察。观察指标：①单位面积线粒体分布密度；
②单位面积线粒体长/宽比；
③单位面积线粒体内空泡数量；
④单位面积线粒体内空泡周长。

2.1 NP小鼠表现出明显的机械性痛敏和热痛敏

手术前1 d将18只C57BL/6J小鼠进行机械性痛和热痛阈值检测，次日，将小鼠制备成SNI模型，随机分为3组：对照组、假手术组和SNI组，每组6只小鼠，分别于手术后1、3、5、7、10、14 d检测小鼠机械性痛和热痛阈值。结果显示：与对照组和假手术组相比，SNI组小鼠手术后3、5、7、10、14 d出现明显的机械性痛敏(P<0.01，图1A)，手术后1 d出现明显的热痛敏，并且持续到14 d(P<0.01，图1B)。手术后14 d取小鼠脊髓腰膨大背角组织，每组3只，使用Western blotting和RT-PCR方法检测出脊髓背角UCP4蛋白和mRNA表达量显著下降(P<0.01，图1C～E)。

A：使用Von Frey检测小鼠机械性痛阈值变化(n=6)；
B：使用热板仪检测小鼠热痛阈值变化(n=6)；
C：手术后14 d，取小鼠脊髓腰膨大背角组织，使用Western blotting法检测脊髓背角UCP4蛋白变化(n=3)；
D：ImageJ计算UCP4蛋白灰度值变化(n=3)；
E：RT-PCR检测脊髓背角UCP4基因mRNA水平表达(n=3)。SNI：坐骨神经选择性损伤。

bP<0.01 vs 对照组；

dP<0.01 vs 假手术组。图1 NP状态下小鼠表现出明显的痛敏行为

2.2 上调脊髓背角UCP4显著缓解小鼠机械性痛敏和热痛敏

在NP状态下，脊髓背角UCP4显著降低[10]。为了阐明UCP4与NP之间的关系，本研究构建UCP4-AAV腺相关病毒，使用立体定位注射仪在脊髓背角分别上调和下调UCP4基因。实验另取18只小鼠分为3组：正常对照组(NC组)、UCP4过表达组(OE组)、UCP4干扰组(KD组)，每组6只小鼠。3组分别于注射病毒2周后构建SNI模型，并于病毒注射15、17、19、21、24、28 d进行行为学检测。结果显示：病毒注射17 d后，OE组与NC组相比，SNI小鼠机械性痛敏和热痛敏得到显著缓解，并且镇痛效果一直持续到28 d(P<0.05)；
而KD组小鼠机械性痛敏和热痛敏症状，与NC组保持相同的变化趋势，无统计学差异(图2A～B)。病毒注射28 d后取小鼠脊髓腰膨大背角组织，每组3只，使用Western blotting和RT-PCR方法检测UCP4蛋白和mRNA表达量的变化，结果显示：注射UCP4过表达病毒和干扰病毒后，脊髓背角UCP4蛋白和mRNA表达量相应地升高和降低，证实了病毒的有效性(图2C～E)。

A：使用Von Frey检测小鼠机械性痛阈值变化(n=6)；
B：使用热板仪检测小鼠热痛阈值变化(n=6)；
C：病毒注射后28 d，取小鼠脊髓腰膨大背角组织，使用Western blotting法检测脊髓背角UCP4蛋白变化(n=3)；
D：ImageJ计算蛋白灰度值变化(n=3)；
E：RT-PCR检测脊髓背角UCP4 mRNA水平表达(n=3)。NC组：正常对照组，OE组：UCP4过表达组，KD组：UCP4干扰组。

aP<0.05， bP<0.01。图2 靶向调节UCP4小鼠行为学结果

2.3 上调脊髓背角UCP4改善线粒体内膜结构，“空泡样”结构消失

由于UCP4定位在线粒体内膜，为明确UCP4的改变是否影响线粒体超微结构的改变，本研究分别取假手术组、NC组、OE组及KD组病毒注射后28 d的脊髓腰膨大组织，使用电镜专用固定液固定，通过透射电子显微镜观察，研究结果显示，与假手术组相比，NC组小鼠脊髓背角线粒体出现大量的“空泡样”结构(图3A～B)，单位面积线粒体“粒”形增多(P<0.01，图3E)，密度增加(P<0.05，图3F)，“空泡样”结构面积和周长变大(图3G～H)。过表达脊髓背角UCP4，线粒体内膜恢复至正常(图3C～H)，而下调UCP4，线粒体“空泡样”结构增多(图3D～H)。线粒体包含双层膜，内膜向内折叠形成嵴。线粒体内部出现的“空泡样”结构，可能是由于线粒体内膜之间空隙的改变导致，即嵴间距增加，提示线粒体嵴间距增加可能与UCP4的变化有关。

A～D：使用透射电子显微镜分别观察假手术组、NC组、OE组、KD组小鼠脊髓背角线粒体的超微结构变化(标尺为500 nm)；
E：线粒体圆率；
F：线粒体密度；
G：空泡面积；
H：空泡周长。NC组：正常对照组，OE组：UCP4过表达组，KD组：UCP4干扰组。n=3， aP<0.05， bP<0.01。图3 NP状态下线粒体超微结构变化

2.4 上调脊髓背角UCP4能够稳定MMP，抗氧化能力增强

线粒体功能异常是痛觉敏化的重要机制[11]，靶向上调UCP4，可以显著缓解小鼠机械性痛敏和热痛敏，线粒体功能是否有改善呢？为了阐明此问题，本研究分别取假手术组、NC组、OE组和KD组病毒注射后28 d的脊髓腰膨大组织，检测MMP、SOD、GSH及ATP的功能指标变化。结果显示，与假手术组相比，NC组小鼠脊髓背角MMP超极化(图4A)，OE组小鼠脊髓背角MMP去极化至恢复正常；
而KD组小鼠MMP依旧超极化，与NC组结果一致(图4B)。抗氧化能力检测结果显示，与假手术组相比，NC组小鼠脊髓背角SOD活性减弱(P<0.01，图4C)，GSH含量降低(P<0.01，图4D)，但不影响ATP的产生(图4E)。过表达脊髓背角UCP4，小鼠脊髓背角SOD活性增强(P<0.01，图4C)，GSH含量升高(P<0.01，图4D)，ATP产生增加(P<0.01，图4E)。而KD组小鼠SOD、GSH和ATP与NC组结果一致(图4C～E)。结果提示UCP4可能通过稳定MMP及增强抗氧化能力参与调节NP。

A：注射病毒28 d后分别取假手术组、NC组、OE组和KD组的脊髓腰膨大组织，使用流式细胞仪检测MMP变化；
B：MMP量化结果；
C：SOD活性检测；
D：GSH含量检测；
E：ATP含量检测。MMP：线粒体膜电位，SOD：超氧化物歧化酶，GSH：谷胱甘肽，ATP：腺嘌呤核苷三磷酸，PE：藻红蛋白，FITC：异硫氰酸荧光素，NC组：正常对照组，OE组：UCP4过表达组，KD组：UCP4干扰组。n=3， bP<0.01。图4 靶向调节UCP4小鼠脊髓背角线粒体功能变化

神经性痛的特征包括持续性痛觉过敏、异位性痛觉和由于躯体感觉神经系统敏感而引起的情感反应，是慢性痛的常见来源。慢性痛可在最初的损伤愈合后持续存在，因此与疼痛传递途径的结构和功能的可塑性变化有关，特别是在初级传入神经和脊髓的水平[12]。在本研究中，作者证实SNI后脊髓背角UCP4表达量下降，同时检测到线粒体内膜出现大量“空泡样”结构，膜电位超极化及抗氧化能力减弱，而靶向上调脊髓背角UCP4，显著缓解小鼠机械性痛敏和热痛敏，具有明显的镇痛效果。线粒体超微结构“空泡样”结构减少甚至消失，MMP恢复正常，抗氧化能力增强。提示UCP4可能在NP的中枢敏化过程中发挥重要作用[10]。

解偶联蛋白家族成员在疼痛的发生发展中发挥重要作用[13]。有研究报道解偶联蛋白UCP1通过激活棕色脂肪中的肾上腺素能受体参与肌肉骨骼痛觉过敏[14]；
UCP2参与紫杉醇诱发的NP机制的调节[15]；
在咬合改变诱发的疼痛机制中，UCP3表达降低[16]。但是对于UCP4在NP中的研究尚且较少，目前仅有课题组前期的研究，结合本文靶向调控UCP4可以显著改善SNI小鼠机械性痛敏和热痛敏的结果，提示UCP4可能在NP的产生与调控中发挥着重要作用，但是具体机制仍有待阐明。

UCP4定位于线粒体内膜，可以跨越脂质双分子层，消除线粒体呼吸链电子传输过程中产生的质子电化学梯度，导致线粒体呼吸链的解偶联，在调控MMP变化、氧化应激等功能中起着关键作用[17]。有文献报道哺乳动物细胞UCP4过表达会导致MMP降低，从而减弱细胞的氧化应激[18]。利用TMRE荧光染色法证明，人UCP4基因在PC12细胞中过表达可降低MMP[19]。在SH-SY5Y细胞中稳定过表达UCP4，保留了ATP合成水平和MMP稳定，且呼吸速率增加[20]。综上所述，UCP4可能通过调节线粒体膜稳定性进而发挥神经元的保护作用。本文作者发现SNI后线粒体内膜出现大量“空泡样”结构，膜电位超极化；
而靶向上调脊髓背角UCP4，线粒体超微结构“空泡样”结构减少甚至消失，MMP恢复正常，SNI小鼠表现出明显的痛阈增加，疼痛缓解。提示UCP4可能通过调控线粒体膜稳定性，增强脊髓背角神经元功能，从而参与NP的调节。

研究证实，在1-甲基-4-苯基吡啶离子毒性介导72 h后的儿茶酚胺能神经元中，UCP4的mRNA和蛋白表达均显著上调，ROS产量减少，UCP4的抑制显著增加了超氧化物水平，减少了降低的GSH含量[21]。本文中SNI小鼠脊髓背角SOD活性减弱和GSH含量减少，而靶向上调脊髓背角UCP4，抗氧化能力恢复至正常水平，证实了这一结论，提示UCP4可能通过改善线粒体抗氧化能力发挥镇痛作用。

NP小鼠上调脊髓背角UCP4，可纠正MMP超极化，并显著恢复线粒体抗氧化功能，可进一步缓解NP，UCP4有望成为治疗NP的新靶点，具有一定的临床意义。目前线粒体及其解偶联蛋白已成为研究疼痛的潜在治疗靶点，但是UCP4具体在脊髓背角的哪类细胞中发挥作用，仍需进一步探究，这也是本课题组下一步的研究计划。

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