白藜芦醇通过Nrf2/HO-1通路对高糖诱导的视网膜神经节细胞损伤的保护作用机制＊

胡 寅，崔 莎，李卓君，胡 琴，邱志方

（1.湖北文理学院附属医院襄阳市中心医院 襄阳 441003；
2.襄阳爱尔眼科医院 襄阳 441003）

糖尿病性视网膜病变是糖尿病最重要的并发症之一，该病可分为增殖性和非增殖性，其中增殖性已经成为成年人致盲的主要原因[1-2]。中国是糖尿病第一大国，预计达到2030年，糖尿病性视网膜病变的患病率已经高达22.4%[3]。目前全球糖尿病性视网膜病变已经超过1700万[4]，故对糖尿病性视网膜病变的防治具有非常重要的意义。糖尿病性视网膜病是与高糖相关的慢性进行性视网膜疾病[5]。糖尿病视网膜病变的发病率比较高，相关研究报道显示，5年内的糖尿病患者发生糖尿病视网膜病变的发病率为4.7%[6]，10年以内发生糖尿病视网膜病变的发病率为7.9%[7]。糖尿病性视网膜病变的发生和发展会引起不同程度的视觉损伤和视力减退。

糖尿病视网膜神经病变主要病理改变为神经胶质细胞增生和神经节细胞凋亡，高糖环境下，低血流灌注会引起视网膜缺氧、缺血，导致神经营养因子缺乏、视网膜神经水肿以及维轴浆流中断，引起视网膜神经的原发性损伤[8-9]。因此，保护高糖损伤的神经节细胞能延缓或可减轻视网膜神经变性。另外，也有研究显示糖尿病视网膜神经病变与氧化应激损伤有关。氧化应激可以损害视网膜内皮细胞和线粒体，导致视网膜缺血缺氧，加重炎症反应，使细胞发生凋亡，最终出现视网膜出血和渗出等[10-11]。

白藜芦醇（Resveratrol，RES）是一种天然的多酚植物抗毒素，存在于葡萄、蓝莓、蔓越莓等天然植物中[12]。RES具有抗氧化活性、改善炎症、清除自由基、延缓衰老、保护神经和心血管的作用[13]。已有研究表明，RES对青光眼视网膜损伤具有一定的保护作用[14]。然而RES是否能改善高糖诱导的视网膜神经节细胞损伤既往少有报道。本研究用链脲佐菌素诱导小鼠发生糖尿病并用RES进行干预，提取小鼠视网膜神经节细胞，检测神经节数量及凋亡情况，并检测氧化应激指标、核因子E2相关因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/血红素氧合酶1（Heme oxygenase-1，HO-1）通路的变化，以期为临床糖尿病性视网膜病变治疗提供理论基础。

1.1 实验动物及分组

野生型C57BL/6小鼠60只和Nrf2敲除的C57BL/6小鼠20只，均购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。12周龄，体质量（28±2）g，许可证号SCXK（湘）2019-0004，将野生型C57BL/6小鼠随机分为3组：对照组、高糖组和RES组，每组20只，Nrf2敲除的C57BL/6小鼠为RES+Nrf2敲除组。

1.2 主要试剂

白黎芦醇，购自美国Selleck，批号：L13007；
RIPA蛋白裂解液，购自武汉Servicebio公司，批号：GB 21009；
HE染色液，购自碧云天生物技术研究所，批号：G1016；
Bax、Cleaved Caspase3、Nrf2、HO-1一抗，购自北京索莱宝科技有限公司，批号：A10036、A12013、A10017、A12073；
多聚甲醛购自美国sigma公司，批号B5011；
BCA蛋白试剂盒，美国Millipore，批号M0119；
MDA、SOD、8-OHdG含量试剂盒，购自北京索莱宝公司，批号190314、190607、190523。

1.3 主要仪器

XSP-63XDV型倒置荧光显微镜（上海光学仪器）；
TGL-16M型台式高速冷冻离心机（上海卢湘仪）；
Calibur流式细胞仪（美国BD公司）；
-80℃超低温冰箱（美国Thermo Scientific）；
酶标仪（美国BioTek公司）。

1.4 方法

1.4.1 糖尿病视网膜病变小鼠模型构建和药物干预

小鼠模型的构建和药物干预参考Luo等[15]人的研究方法进行，高糖组和RES组、RES+Nrf2敲除组中的小鼠禁食8-10 h，按照小鼠体质量60 mg·kg-1剂腹腔注射链脲佐菌素，连续注射5天后，第7天取小鼠尾部静脉血检测血糖，血糖＞11.1 mmol·L-1作为糖尿病成功建模的标准，对照组小鼠连续注射等量的柠檬酸缓冲液5天。再将各组小鼠连续饲喂专用饲料3个月，每个月进行1次眼底检查，糖尿病小鼠出现视网膜出血或者新生血管，即糖尿病视网膜病变小鼠模型成功，对照组的小鼠给予正常饲料喂养。将RES溶解在25%乙醇中，然后用生理盐水稀释，RES组和RES+Nrf2敲除小鼠每天腹腔注射20 mg·kg-1的RES，连续注射5天，对照组小鼠注射等体积的生理盐水，连续注射5天。

1.4.2 HE染色

将小鼠麻醉并处死，取出大鼠的部分视网膜组织在4%多聚甲醛中进一步固定1 h。用不同浓度的酒精作为脱水剂，逐渐去除组织块中的水分。用二甲苯代替组织块中的酒精，然后用蜡包埋组织，切片机取薄切片。苏木精和伊红溶液染色，光学显微镜拍照。

1.4.3 神经节细胞提取和鉴定

按照Altmann[16]等方法提取各组小鼠的视网膜神经节细胞，小鼠麻醉处死，钝性分离眼球，去角膜，巩膜、玻璃体，分离获得到视网膜神经上皮层，置于玻璃试管的木瓜蛋白酶混合溶液中。20 min后，丢弃液体，加入DMEM/F12细胞培养液制成悬液，调整细胞密度10×106cells·mL-1，将稀释后的细胞悬液加入6孔板中，显微镜下观察细胞浓度及细胞贴壁，将稀释后的5-Fu和尿苷混合储备溶液加入6孔板中，置于37℃的5%的CO2中培养，24 h后，弃去原培养基，4%多聚甲醛固定30 min，加l mL破膜工作液，室温孵育l0 min，PBS洗3次，滴加3%的过氧化氢溶液，避光孵育20 min，弃除3%过氧化氢溶液，滴加一抗Brn3a，4oC孵育过夜。再加CY3标记二抗，室温孵育50 min，加入非特异性细胞核染色液DAPI染液，室温孵育，统计每个视网膜显微镜视野内的细胞数量，使用Image J软件进行手工计数。

1.4.4 流式细胞仪检测

视网膜神经节细胞凋亡率收集各组细胞样本，采用荧光双染色法（Annexin V-FITC/PI）在流式细胞仪上进行细胞凋亡率检测，PBS洗涤贴壁细胞，加入胰酶消化细胞，再加入培养基终止消化，用移液枪轻轻吹打细胞制成悬液，转移至流式管，离心处理，300 r·min-1离心5 min，弃上清，加入3 mL PBS重新悬浮细胞，采用300 μL Binding Buffer重悬，在加入5 μL Annexin V-FITC和PI，避光孵育5 min，上流式细胞仪检测。

1.4.5 氧化应激指标检测

每组取5只小鼠分离小鼠视网膜组织，采用RIPA裂解液均浆，然后进行离心处理，4℃离心25 min（2500 r·min-1），按ELISA试剂盒说明书操作，检测超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）的含量。

1.4.6 Western blot检测凋亡相关蛋白及Nrf2和Ho-1蛋白表达

每组取5只小鼠分离小鼠视网膜组织，采用RIPA缓冲液收集蛋白样品，使用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度，使用12% SDS-PAGE在140 V电压下分离样品中的不同蛋白质，然后以300 mA的电流将蛋白质转移到PVDF膜上，加入Bax（1∶500稀释）、Cleaved Caspase3（1∶500 稀 释）、Bcl2（1∶500 稀释）、Nrf2（1∶1000稀释）和HO-1（1∶1000稀释）一抗，37℃孵育1 h，PBS缓冲液洗3次。然后，将山羊抗兔IgG（1:5000稀释）与该膜在37℃下孵育1 h，滴加ECL混合溶液到膜的蛋白面侧，暗室中曝光，A1phaEaseFC软件处理系统分析目标带的光密度值。

1.4.7 统计学处理

采用SPSS 23.0软件统计学分析，数据均符合正态分布，采用t检验或ANOVA检验。以均数±标准差（）表示，多样本间比较用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 RES对视网膜组织的影响

HE染色结果显示，高糖组的视网膜神经节细胞层（GCL）和内核层（INL）明显的消失或减少，外核层（ONL）厚度也显著下降。与高糖组相比，RES组可以减轻高糖诱导引起的损伤，而RES+Nrf2敲除组较RES组相比，视网膜神经节细胞层（GCL）、内核层（INL）有所减少，外核层（ONL）厚度有所降低，见图1A。高糖组视网膜厚度明显低于对照组（P＜0.01），RES组视网膜厚度显著高于高糖组（P＜0.05），RES+Nrf2敲除组视网膜厚度相对低于RES组（P＜0.05）。见图1B。

2.2 RES对神经节细胞数量的影响

高糖组中的神经节数量明显低于对照组（P＜0.05），RES组中的神经节数量明显高于高糖组（P＜0.05），RES+Nrf2敲除组中的神经节数量显著低于RES组（P＜0.05），见图2。

2.3 RES对神经节细胞凋亡的影响

高糖组中的凋亡率明显高于对照组（P＜0.05），RES组中的凋亡率明显低于高糖组（P＜0.05），RES+Nrf2敲除组中的凋亡率显著高于RES组（P＜0.05），见图3。

2.4 RES对神经节细胞凋亡相关蛋白的影响

高糖组中的Bax和Cleaved Caspase3蛋白表达明显高于对照组（P＜0.05），RES组中的Bax和Cleaved Caspase3蛋白表达明显低于高糖组（P＜0.05），RES+Nrf2敲除组中的Bax和Cleaved Caspase3蛋白表达显著高于RES组（P＜0.05），见图4A、4B和4C；
高糖组中的Bcl2蛋白表达明显低于对照组（P＜0.05），RES组中的Bcl2蛋白表达明显高于高糖组（P＜0.05），RES+Nrf2敲除组中的Bcl2蛋白表达显著低于RES组（P＜0.05），见图4A和4D。

2.5 RES对小鼠视网膜氧化应激的影响

高糖组中的SOD水平明显高于对照组（P＜0.05），RES组中的SOD水平明显高于高糖组（P＜0.05），RES+Nrf2敲除组中的SOD水平显著低于RES组（P＜0.05），见图5A；
高糖组中的MDA和8-OHdG水平明显低于对照组（P＜ 0.05），RES组中的MDA和8-OHdG水平明显低于高糖组（P＜0.05），RES+Nrf2敲除组中的MDA和8-OHdG水平显著高于RES组（P＜0.05）。见图5B和5C。

图1 视网膜组织HE染色（×100）

图2 RES对神经节细胞数量的影响

2.6 RES对Nrf2和HO-1蛋白表达的影响

高糖组中Nrf2和HO-1的蛋白表达显著低于对照组（P＜0.05），RES组中Nrf2和HO-1的蛋白表达明显高于高糖组（P＜0.01），RES+Nrf2敲除组Nrf2和HO-1的蛋白表达显著低于RES组（P＜0.05）。见图6A和6B。

图3 RES对神经节细胞凋亡的影响

图4 RES对神经节细胞凋亡相关蛋白的影响

图5 RES对小鼠视网膜氧化应激的影响

图6 RES对Nrf2和Ho-1蛋白表达的影响

3.1 高糖诱导视网膜神经节细胞损伤

在视网膜的各级神经元中，神经节细胞是视网膜中唯一参与形成视神经纤维的神经元，也是唯一把视网膜视觉信息传递到视觉中枢的传出神经元，在视觉形成中有重要作用[17]。高糖导致的神经节细胞损伤主要与谷氨酸兴奋性毒性、免疫炎症损伤、氧化应激、线粒体功能障碍、钙离子超载和神经营养因子缺乏等有关[18]。本研究建立糖尿病视网膜病变小鼠模型，发现视网膜神经节细胞层和内核层明显消失或减少，外核层厚度也显著下降，另外神经节数量明显减少。另外还发现，高糖可导致视网膜神经节细胞的凋亡明显增加，并且出现氧化应激损伤。这与既往报道一致[17]。

3.2 RES对视网膜神经节细胞损伤、凋亡及氧化应激的改善作用

现代药理学研究显示[14]，RES具有抗氧化活性、改善炎症、清除自由基、延缓衰老、保护神经和心血管的作用，被证实可有效抑制视网膜损伤。然而RES对高糖诱导的视网膜神经节细胞损伤的改善作用既往少有报道。本研究采用HE染色验证RES对视网膜组织的影响，结果显示RES可以减轻高糖诱导引起的损伤，增加神经节数量，以及GCL、INL和ONL。视网膜损伤与氧化应激、凋亡密切相关。糖尿病可造成视网膜神经节细胞轴突突触功能障碍和不可逆的损伤，从而阻断视觉信号的传递，导致视网膜神经节细胞凋亡，最终造成视功能不可逆性损伤[19]。氧化应激可以损害视网膜内皮细胞和线粒体，导致视网膜缺血缺氧，加重炎症反应，进一步促进细胞凋亡，最终出现视网膜出血和渗出等[10-11]。本研究发现，RES干预后SOD水平升高，MDA和8-OHdG水平明显降低，同时Nrf2和Ho-1的蛋白表达明显升高。另外Bax和Cleaved Caspase3蛋白表达水平降低，而Bcl2蛋白表达水平升高，提示RES可以通过降低凋亡和氧化损伤而改善受损的视网膜神经节细胞。

3.3 RES通过Nrf2/HO-1通路发挥作用

Nrf2/HO-1通路与氧化应激密切相关，是保护机体免遭活性氧导致内源性和外源性应激损伤的主要细胞通路，Nrf2是细胞抗氧化应激的关键转录因子，当受到氧化活性物质刺激时Nrf2和HO-1启动子部位结合，调控下游抗氧化酶和II相代谢酶基因的转录活动，增强机体抗氧化能力[20]。越来越多的研究表明，Nrf2/HO-1通路在糖尿病大鼠视网膜氧化应激反应中起着最重要的作用，比如白皮杉醇可通过激活Nrf2/HO-1通路促使糖尿病大鼠视网膜氧化还原状态的恢复[21]，桦褐孔菌多糖经Nrf2信号通路可明显抑制糖尿病大鼠视网膜组织氧化应激和炎症反应[22]。RES是否可作用于Nrf2/HO-1通路，既往未见报道。但有研究发现[23]，RES对H2O2诱导的HaCaT细胞氧化损伤具有保护作用，而这种保护作用可能依赖于HO-1的表达。本研究敲除Nrf2基因后，RES对视网膜神经节细胞的抗凋亡和抗氧化应激作用发生逆转，提示RES可能是通过Nrf2/HO-1通路发挥作用。

3.4 总结

综上所述，RES对糖尿病性视网膜病变小鼠视网膜和神经节细胞具有一定的保护作用，RES通过激活Nrf2和HO-1抑制氧化应激，从而抑制神经节细胞的凋亡，保护糖尿病性视网膜病变视网膜的完整性。

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