Cry1Ah蛋白对多异瓢虫和日本通草蛉的安全性评价

潘洪生，王冬梅，姜 岩，阿克旦·吾外士，李号宾

（新疆农业科学院植物保护研究所/国家植物保护库尔勒观测实验站，乌鲁木齐 830091）

1996年，美国开始商业化种植转基因抗虫棉花，其种植面积在印度、澳大利亚、阿根廷、南非、墨西哥和哥伦比亚等国家迅速增加。2018年全球共有26个国家和地区种植转基因作物，其中棉花种植面积为2490万公顷[1]。转基因抗虫棉花可有效控制棉铃虫Helicoverpa armigera和红铃虫Pectinophora gossypiella等靶标害虫的为害，在棉花害虫综合防控中发挥了重要作用[2,3]。转基因抗虫作物的利用虽然能够有效控制害虫，但同时也存在潜在的风险。因此，转基因抗虫作物商业化种植前的环境安全性评价就显得尤为重要[4]。非靶标生物在农田系统中具有重要的生态功能，环境安全性评价研究的昆虫主要集中在捕食性天敌、寄生性天敌、经济昆虫、非靶标害虫和传粉昆虫等[5]。

瓢虫和草蛉是棉田重要的捕食性天敌，不仅可取食棉蚜Aphis gossypii等多种蚜虫、棉铃虫的卵和低龄幼虫，而且其成虫还可取食棉花等作物的花粉和花蜜[6,7]。目前，不同转基因抗虫作物和不同Cry杀虫蛋白对瓢虫和草蛉的环境安全性评价已有大量研究。例如，转Cry1Ac和Cry1Ac/Cry2Ab基因抗虫棉花对龟纹瓢虫Propylea japonica和大斑长足瓢虫Coleomegilla maculate无明显的不利影响[8,9]。雒珺瑜等[10]发现饲喂取食转双价抗虫棉（表达Cry1Ac和Cry2Ab蛋白）和单价抗虫棉（表达Cry1Ac蛋白）的棉铃虫初孵幼虫后，中华草蛉Chrysopa sinica幼虫的发育历期与常规棉花相比略有延长，但差异未达显著水平。张小洁[11]研究表明转Cry2A和Cry1C基因水稻的种植不会对龟纹瓢虫的生长发育产生负面影响。取食转Cry1Ab或Cry3Bb1或CrylAb/2Aj和CrylAc基因玉米的花粉后，普通草蛉Chrysoperla carnea、日本通草蛉Chrysoperla nipponensis、深点食螨瓢虫Stethorus punctillum和龟纹瓢虫的存活率、产卵前期和日均产卵量等生命表参数均没有显著不利影响[12-14]。利用Cry2Ab、Cry1Ac＋Cry2Ab和Cry1Ah蛋白处理的棉铃虫幼虫来饲喂龟纹瓢虫、七星瓢虫Coccinalla septempunctata和大草蛉Chrysopa pallens后，各项生物学参数与对照相比均没有显著性差异[6,7,15]。此外，Cry1Ac、Cry1Ab、Cry1Ab/2Aj、Cry2Aa、Cry2Ab、Cry2A、Cry1B、Cry3Bb1、Cry1C、Cry1Fa、Cry1F、Cry1Ie和Cry2Ah蛋白对龟纹瓢虫、异色瓢虫Harmonia axyridis、二星瓢虫Adalia bipunctata、大草蛉、中华草蛉、日本通草蛉和普通草蛉无毒性，对体内主要消化酶、解毒酶和保护酶活性无显著影响[7,16-22]。

Cry1Ah基因是中国农业科学院植物保护研究所分离克隆的具有自主知识产权的杀虫基因，其蛋白与棉铃虫上的氨肽酶（Aminopeptidase，简称 APN）能够特异的结合，对棉铃虫幼虫具有杀虫特异性[23,24]。然而，Cry1Ah蛋白对多异瓢虫Hippodamia variegata和日本通草蛉的潜在影响尚未见报道。本研究评价大于田间转基因棉花中Bt 蛋白表达量 20 倍剂量的高浓度Cry1Ah蛋白对多异瓢虫幼虫发育历期、存活率、体质量以及多异瓢虫和日本通草蛉雌雄成虫寿命、雌虫产卵量等生物学指标的影响，为转Cry1Ah基因抗虫棉花商业化释放前系统安全性评价提供技术支撑。

1.1 供试昆虫与蛋白

多异瓢虫成虫采自国家植物保护库尔勒观测实验站（新疆巴州库尔勒市和什力克乡库勒村，41.75° N，85.81° E）周边棉田田埂的甘草Glycyrrhiza uralensisFisch和骆驼刺Alhagi sparsifoliaShap上。在实验室内用甘草、骆驼刺上的棉黑蚜Aphis atrata在1.2 L养虫盒中进行饲养。实验室环境条件控制在温度（25±1）℃、相对湿度（65±5）%、光周期14L∶10D。成虫产卵孵化出的整齐一致的初孵幼虫用于试验。

日本通草蛉成虫采自中国农业科学院西部农业研究中心（44.26° N，87.34° E）常规棉田，在实验室内，放于大玻璃罐中（直径20 cm，高25 cm），罐口覆盖棉纱布，罐中放置2 cm厚海绵，成虫用5 mL注射器注射20%蜂蜜水进行饲养，幼虫用麦蛾Sitotroga cerealella(Olivier)卵和人工饲料[25]进行扩繁，至少4个世代后用于试验。养虫室环境条件为（25±1）℃，相对湿度（65±5）%，光周期14L∶10D。

Cry1Ah杀虫蛋白购自北京绽诺思特生物科技有限公司。

1.2 Cry 1Ah蛋白对多异瓢虫幼虫生长发育的影响

首先配制500 μg/mL的Cry1Ah蛋白稀释液，然后向其中加入有机硅表面活性剂（南京沃博生物科技有限公司），使其在稀释液中的浓度为0.1%。接着用喷壶将10 mL的Cry1Ah蛋白稀释液喷在实验室连续饲养多代的育苗盘中有桃蚜的豌豆苗上，尽量让桃蚜体表布满Cry1Ah蛋白稀释液。室温放置2 h后，用上述处理过的桃蚜饲养多异瓢虫。以饲喂仅喷浓度为0.1%有机硅表面活性剂的桃蚜为对照。

将初孵的多异瓢虫幼虫单头接入玻璃烧杯（外径4.5 cm，内径3.8 cm，高6.0 cm）中，烧杯上覆盖120目尼龙纱布，并以橡胶皮筋固定。分别饲喂处理和对照的桃蚜（约250头），置于25 ℃，RH 65%，光周期14:10（L:D）的培养箱（RXZ-500型，宁波江南仪器厂）中饲养。每天更换食物并检查幼虫存活情况（用零号毛笔轻扫虫体，若虫体长时间不动或虫体变形、变色判断为死亡）与龄期变化情况。待幼虫化蛹后，分别记录化蛹日期和羽化日期。同时，蛹羽化为成虫后，确定其性别（雄虫第5腹板后缘线微凹入，第6腹板后缘平截；
雌虫第5腹板舌形向后凸出，第6腹板基部有三角形下凹，后缘尖形凸出），并用万分之一电子天平单头称量新羽化成虫的质量。处理和重复均重复3次，每个重复观察30头。

1.3 Cry 1Ah蛋白对多异瓢虫成虫寿命与繁殖能力的影响

取新羽化的多异瓢虫雌、雄成虫各一头置于玻璃烧杯中进行单对饲养，分别饲喂处理和对照的桃蚜（约250头），置于（25±1）℃，相对湿度（65±5）%，光周期14L∶10D的培养箱中饲养。每天更换食物，连续观察20 d雌、雄成虫的寿命以及雌虫产卵量。处理和对照均重复3次，每个重复观察20对。

1.4 Cry 1Ah蛋白对日本通草蛉成虫寿命与繁殖能力的影响

首先以50 mmol的Na2CO3溶液为溶剂配制20%的蜂蜜水，然后将Cry1Ah蛋白用20%的蜂蜜水配成浓度为500 μg/mL的稀释液。

将新羽化的日本通草蛉雌、雄成虫配对，放在大玻璃罐中，罐口覆盖棉纱布，用清水饲养48 h后，继续用500 μg/mL的Cry1Ah蛋白稀释液饲养。以继续用20%的蜂蜜水溶液饲养为对照。饲养方法同“1.1”。放在（25±1）℃，相对湿度（65±5）%，光周期14L∶10D的培养箱中饲养。每日更换干净海绵和棉纱布，并记录雌、雄成虫的寿命及雌虫产卵量，一直持续到全部成虫死亡。处理和重复均重复3次，每个重复观察20对。

1.5 数据统计与分析

采用Microsoft Excel 2003和SPSS 20对所有数据进行统计分析。多异瓢虫和日本通草蛉的发育历期、存活率和体质量以及雌、雄成虫寿命，产卵量等生物学参数采用独立样本t检验法进行差异显著性分析。

2.1 Cry1Ah蛋白对多异瓢虫幼虫生长发育的影响

Cry1Ah蛋白对多异瓢虫幼虫生长发育的影响如表1所示。取食体表布满Cry1Ah蛋白的桃蚜后，多异瓢虫幼虫的存活率（P＝0.386）、幼虫历期（P＝0.805）、蛹历期（P＝0.229）及体质量（P＝0.450）与对照间差异均不显著。这说明Cry1Ah蛋白对多异瓢虫幼虫的各项生命指标均无显著的不利影响。

表1 Cry1Ah蛋白对多异瓢虫幼虫生命指标的影响Table 1 Effect of Cry1Ah protein on the life indicators of H.variegata larvae

2.2 Cry 1Ah蛋白对多异瓢虫成虫寿命与繁殖能力的影响

Cry1Ah蛋白对多异瓢虫成虫寿命与繁殖能力的影响如图1所示。取食体表布满Cry1Ah蛋白的桃蚜后，多异瓢虫雌、雄成虫寿命（雌：P＝0.821，雄：P＝0.576），雌虫产卵量（P＝0.802）均与对照无显著性差异。这说明Cry1Ah蛋白对多异瓢虫成虫寿命及繁殖能力均无显著的不利影响。

图1 Cry 1Ah蛋白对多异瓢虫成虫寿命（A）与繁殖能力（B）的影响Fig.1 Effects of Cry1Ah protein on the longevity (A) and fecundity (B) of H.variegata adults

2.3 Cry1Ah蛋白对日本通草蛉成虫寿命与繁殖能力的影响

Cry1Ah蛋白对日本通草蛉成虫寿命与繁殖能力的影响如图2所示。取食含Cry1Ah蛋白的蜂蜜水后，日本通草蛉雌、雄成虫寿命（雌：P＝0.890，雄：P＝0.556），雌虫产卵量（P＝0.959）与对照间均无显著性差异。这说明Cry1Ah蛋白对日本通草蛉成虫寿命及繁殖能力均无显著的不利影响。

图2 Cry 1Ah蛋白对日本通草蛉成虫寿命（A）与繁殖能力（B）的影响Fig.2 Effect of Cry1Ah protein on the longevity (A) and fecundity (B) of C.nipponensis adults

转基因抗虫作物对非靶标生物影响的评价，以非靶标生物接触到杀虫蛋白的途径和浓度来评估转基因作物组织内表达的杀虫蛋白对该生物的毒性作用和生态安全性为依据，评价某一杀虫蛋白对非靶标生物的毒性作用，需选择合适的非靶标指示性生物[4]。其中，作为农田生态系统中重要的自然天敌需要优先考虑[26]。多异瓢虫和日本通草蛉是新疆农田中主要的捕食性天敌，分布范围广，在室内易于饲养，生物学指标易于观察，是室内测试时合适的指示物种。苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一种昆虫病原细菌，依赖于杀虫晶体蛋白来杀死昆虫幼体宿主，几乎完全专一针对不同目的昆虫幼虫阶段，破坏中肠组织以达到杀死昆虫的目的。从Bt中克隆的Cry1Ah基因编码一种对几种鳞翅目害虫具有高杀虫毒性的蛋白，如亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis，LC50= 0.05μg/g）、棉铃虫（LC50＝1.48 μg/g）和水稻二化螟（Chilo suppressalis，LC50＝0.98 μg/g）[27]。目前，Cry1Ah1基因已经转化到玉米中，对一些鳞翅目害虫表现出很强的控制作用[28,29]。对Cry1Ah蛋白和Cry1Ah1转基因作物进行风险评估时，尚未发现对蜜蜂存活、发育、行为的不利影响[30,31]。本文研究Cry1Ah蛋白对多异瓢虫幼虫、成虫和日本通草蛉成虫的各项生命指标的影响，发现Cry1Ah蛋白对这两种捕食性天敌无明显的不利影响。

虽然转 Bt基因抗虫作物对农田几种鳞翅目害虫起到了很好的控制作用，但长期的高压选择，也致使这些害虫对转 Bt基因抗虫作物产生了一定的抗性。小菜蛾在四种 Bt杀虫晶体蛋白（Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ah和Cry1Ca）的选择压力下，存在不同程度的抗药性[32,33]。因此，挖掘新的Bt基因，培育和Cry1Ac不同作用机制的新型抗虫棉花品种，对棉铃虫等鳞翅目靶标害虫的抗性治理具有重要意义。目前，孟山都开发的第二代Bt棉花，如Cry2Ab2和Cry1Ac双价抗虫棉已在美国、澳大利亚和印度商业化种植[34]。而国内将 Cry1C*基因、Cry2A*基因和 CryNGc基因转入水稻，获得抗鳞翅目害虫，如稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis、二化螟和三化螟Tryporyza incertulas的转基因水稻[35,36]，将Cry1Ie基因和CryNGc基因转入玉米，获得抗虫转基因玉米[37,38]，将 Cry1C*基因转入棉花，获得抗虫性好的棉花植株[39]。这些研发出的新一代 Bt转基因作物，将为转基因抗虫作物的持续利用提供坚实的科技支撑。然而，这些新型转基因作物的环境生态安全性，尤其是对天敌等非靶标生物的影响有待进一步系统评估。

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