MicroRNA-29c,表达与胃癌临床病理特征的关系研究

张永芳，李京城，解 娜，3，陈 艳，陈俊明，黄幼生

（1.海南医学院第一附属医院病理科，海南 海口 570100；
2.海南医学院第一附属医院检验科，海南 海口 570100；
3.海南医学院口腔组织病理学教研室，海南 海口 570100）

在2020 年全球癌症统计中，胃癌居全球癌症发病率的第5 位及死亡率的第4 位。当前，中国胃癌新发病例和致死病例均高于世界平均水平［1］。胃癌的发展涉及各种遗传和表观遗传学改变，探究胃癌发展的分子机制有助于为临床寻找有效治疗手段的生物标志物。根据近年研究结果，微小RNA（microRNA，miRNA）参与肿瘤的发生、进展，是癌症表观遗传变化的关键因素［2］，成为有前景的诊断及预后标志物和潜在的治疗靶点［3］。

miRNA 属于非编码RNA，在RNA 层面行使其生物学功能，不直接编码蛋白质，其发挥作用主要通过与其靶基因的完全或不完全结合，介导靶mRNA 降解或抑制靶mRNA 翻译，从而负调节基因表达［4］。miR-29c 和miR-29a、miR-29b 同属于miR-29 家族，既往研究表明miR-29c 在大部分人类癌症中表达下调，包括鼻咽癌［5］、肺癌［6，7］、胃癌［8，9］、宫颈癌［10］、肝细胞癌［11］等。Yoshimasa 等［12］发现miR-29c 的下调与胃癌的进展有关，并且在晚期胃癌中比在胃腺瘤和早期胃癌中更为突出。然而有研究结果表明miR-29c 表达水平与临床病理参数没有任何相关性［13］，Han 等［9］对113 例胃癌FFEP 组织进行了分析，认为miR-29c 表达的丧失是胃癌发生的早期事件。由此可见胃癌miR-29c 表达与临床病理特征的关系尚不明晰，在不同的研究中，研究对象和研究方法的不同可能是导致结果不一致的原因，在以往的相关研究中，多采用新鲜组织和石蜡组织，但新鲜组织难以获取，石蜡组织中RNA 降解较快，本研究采用的miRNAscope 技术则很好地解决了这个问题，其独特的探针设计极大提高了在石蜡组织中检测RNA 的灵敏度和特异性，并可以同时观察组织形态和信号表达。

据此，本研究首先利用TCGA 数据库分析miR-29c 在胃癌和正常组织中的表达情况，其次通过miRNAscope 技术对生信分析的结果进行验证，并进一步分析miR-29c 的表达与胃癌临床特征间的关系，为阐明胃癌发生发展的分子机制及开发新的胃癌靶向药物奠定理论基础。

1.1 一般资料

基于癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库，获取胃癌miRNA 表达数据及临床数据，得到434 例胃癌miRNA 表达数据，其中有41 例有配对正常组织表达数据。排除标本重复、非原发性胃癌、有术前放化疗病史等病例后，总共有372 例胃癌标本纳入临床特征相关分析，生存分析仅去除生存资料不完整的样本，共405 例。

收集2020 年1 月～2022 年6 月在海南医学院第一附属医院外科手术切除的胃癌标本，包括73 例原发性胃癌组织及71 例正常组织，其中71 例胃癌组织有配对的正常组织，均经中性福尔马林固定制成石蜡标本。纳入的病例在术前均未进行放、化疗，并经病理检查确诊，根据美国癌症联合委员会（AJCC，第8 版）的标准进行TNM 分期。表1 总结了73 例胃癌患者的临床因素，包括年龄、性别、组织学分型和淋巴结转移等。本研究标本使用经过海南医学院第一附属医院伦理委员会讨论通过，参加本研究的所有胃癌患者均签署了书面知情同意书。

表1 miR-29c 表达与胃癌患者临床病理特征的关系Tab 1 Relationship between expression of miR-29c and clinicopathological features in gastric cancer patients

1.2 主要试剂

miRNAScopeTM miR-29c 探 针（货 号 ：1058391），miRNAscope®H2O2and Protease 试剂盒（货号：322381），miRNAscopeTM HD 检测试剂盒（红色，货号：324510）均购自美国ACD 公司。

1.3 生物信息学分析

1.3.1 miR-29c 差异分析 根据胃癌组织和正常胃组织的分组，使用“edgeR”包进行差异表达分析，设置显著性阈值为差异倍数的绝对值≥1，且错误发现率＜0.05，对其中配对的胃癌、正常组织进行配对秩和检验，P＜0.05 有统计学差异。

1.3.2 miR-29c 临床特征与预后分析 根据“survival”包计算miR-29c 的最优cutoff 值，将样本分为miR-29c 高表达和miR-29c 低表达组，并分析各临床因素（肿瘤部位、浸润深度、淋巴结转移等）在此分组间的统计学差异。Kaplan-Meier 法对生存资料进行描述，Log-rank 检验评估miR-29c 高、低表达组间总生存期的统计学差异。

1.3.3 miR-29c 靶基因预测及富集分析 在mirtarbase［14］在线网站预测miR-29c 的下游基因，下载有至少2 个证据支持的miR-29c 靶基因。同时，使用TargetScan［15］、PicTar［16］和Starbase［17］在线软件预测miR-29c 可能调控的下游基因，并通过TargetScan查找其与miR-29c 的结合位点，将在线网站（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）筛选的4 重叠的靶标基因作为miR-29c 候选靶标基因。将候选靶标基因输入DAVID（The Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery）在线网站进行富集分析，包括GO 功能注释和KEGG 通路分析，探索miR-29c 可能涉及的生物学功能。

1.4 实验方法

1.4.1 组织芯片制作 将胃癌及正常FFPE 标本制成HE 切片，显微镜下选择代表性的组织（癌旁正常胃黏膜组织距离癌组织＞5 cm），然后应用空芯针制备组织芯片。从每个组织蜡块的代表性区域戳出直径约1.4 mm 的圆柱体，并嵌入已钻孔的空白蜡块中，蜡块置于模具上，表面淋热蜡封边，在烤箱（60 ℃）放置1h，使石蜡稍融化以封闭组织块，室温放置冷却，再放入4 ℃冰箱1h后脱模。

1.4.2 miRNAscope 原位杂交法检测miR-29c 表达 将厚度为3.5 um 的组织芯片在60 °C 下烘烤1.5 h，在新鲜二甲苯中脱蜡，在新鲜乙醇中脱水，然后用12%甲醛室温下固定2 h，用过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，然后将组织切片在靶标修复液中保持在沸点（98 °C～102 °C）下孵育15 min，用ImmedgeTM疏水笔画疏水圈，用蛋白酶Ⅲ覆盖组织，在HybEZ 二代杂交炉中40 °C 处理30 min，用miRNAScopeTMmiR-29c 探针覆盖组织，杂交2 h。使用miRNAscopeTMHD 检测试剂盒进行信号检测，Amp1-Amp6 依次放大杂交信号，将Fast-RED 溶液A 和B（60∶1）混合对组织进行显色，最后经苏木精复染，在通风橱干燥后用中性树胶封片，Hs-RNU6为阳性对照，Sramble 为阴性对照，在标准光学显微镜下观察miRNAscope 结果。

1.5 结果判读

miRNAscope 结果分为4 个级别：0 分（平均每个细胞染色点为0 或≤1 个点/每10 个细胞，40 倍视野），1 分（2 个～10 个点/细胞，没有或很少细胞簇，40 倍视野），2 分（11 个～20 个点/细胞和或＜25%的阳性细胞有点状团簇，20～40 倍视野），3 分（＞20个点/细胞和或＞25%的阳性细胞有点状团簇，20倍视野），其中0 分和1 分为低表达，2 分和3 分为高表达。

1.6 统计学处理

用 R4.0.3 及SPSS 26.0 统计软件，分类变量比较使用卡方检验，配对的连续性变量比较使用配对秩和检验，生存分析使用Log-rank 检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 TCGA 数据库中miR-29c 差异分析

结果显示，与正常胃黏膜组织相比（中位表达值12.510 54，n=41），miR-29c 在胃癌组织（中位表达值10.879 42，n=434）中的表达显著下调（P＜0.001）；
在配对的41 例组织中，miR-29c 在胃癌组织的表达同样显著下调（P＜0.001）。见图1。

图1 TCGA 数据中miR-29c-3p 的表达图Fig 1 Expression diagram of miR-29c-3p in TCGA data

2.2 TCGA 数据库中miR-29c 表达与临床病理特征及预后的关系

miR-29c 的表达与胃癌患者年龄、性别、部位、分级、TNM 分期、T 分期、N 分期无明显相关（P＞0.05），对miR-29c 表达与胃癌患者总生存期的分析显示，miR-29c 高表达组生存率高于低表达组，但差异没有显著性（P=0.141）。

2.3 miR-29c 靶基因预测及富集分析

为了进一步探讨miR-29c（图2A）的生物学功能，本项目通过在线数据库预测miR-29c 调控的下游基因，miRNA 预测阈值设定如下：Pictar 得分大于2 分，得到449 个候选靶基因；
TargetScan 保守性结合位点数＞0 且总评分值＜-0.4，得到365 个候选靶基因；
Starbase CLIP Data 数≥3，Pan-Cancer 数≥10，得到809 个候选靶基因。另外从mirtarbase 网站下载了242 个已被证实的miR-29c 的下游mRNA，其中有2 个及以上证据支撑的有161 个，使用在线网站对预测结果取交集，得到18 个候选靶基因（图2B）。GO 功能注释结果显示（图2C），18 个潜在的靶基因主要注释主要包括细胞外基质结构成分、DNA 甲基化转移酶活性、蛋白结合等生物学功能；
KEGG 通路主要富集在癌症相关miRNAs、肿瘤相关信号途径、PI3K-AKT、ECM 受体相互作用等信号通路上（图2D）。

图2 miR-29c 靶基因预测及富集分析Fig 2 Target genes prediction and enrichment analysis of miR-29c

2.4 胃癌组织中miR-29c 表达及其与患者临床病理特征关系的验证

为了进一步证实TCGA 数据分析结果，本项目应用miRNAscope 技术检测miR-29c 的表达水平，结果显示73 例胃癌组织中miR-29c 高表达组29 例，低表达组44 例，高表达率为39.7%（29/73）；
71 例正常组织中miR-29c 高表达组64 例，低表达组7 例，高表达率为90.14%（64/71）。与正常组织相比，miR-29c 在胃癌组织中表达明显下调（χ2=39.995，P＜0.001）。见图3。对73 例胃癌患者miR-29c 的表达及临床病理特征相关性进行分析，结果显示miR-29c 的表达水平与胃癌患者TNM 分期、淋巴结转移、组织学分型有关（P均＜0.05），与年龄、性别、部位、浸润深度、脉管侵犯均无关。见表1。

图3 miR-29c 在胃癌及正常组织中的表达（200×）Fig 3 Expression of miR-29c in gastric cancer and normal tissues（200×）

胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，内镜切除已成为早期胃癌有效的治疗策略，但由于常常发现较晚，缺乏有效的治疗方案，导致其生存率普遍较低，给人类生命健康造成了严重的威胁及巨大的经济负担。近年来，肿瘤靶向治疗得到快速发展，例如，靶向HER2基因的赫赛丁治疗能提高乳腺癌及胃癌患者生存率［18，19］。然而，靶向药物仍有适用人群窄、容易耐药等缺陷，因而探索新的、更精确的生物标记物是当前研究重点。

miRNAs 作为表观遗传学变化的关键因素，是多种靶基因的内源性沉默子，在多种恶性肿瘤中存在异常表达［20］。前期研究显示，多种miRNA 包括miR-29c 在胃癌组织中异常表达，参与调控癌细胞黏附、迁移、基因表达等功能活动，与AKT、MAPK、p53 等信号通路活化相关［21］。有研究证明miR-29c通过RhoA/ROCK 信号通路参与调控胃癌细胞的迁移和凋亡［22］，Li 等［23］对60 例胃癌患者的新鲜组织样本分析结果显示，miR-29c 在不同肿瘤分期组间差异有统计学意义（P=0.049），Han 等［9］发现miR-29c 在胃癌组织中的表达下调，但未发现与胃癌临床病理特征有直接关系，其结果是提取石蜡组织RNA 进行qPCR 分析而得出，然而石蜡组织中的RNA 降解严重，且miR-29c 在癌组织中的丰度非常低，因而采取这种方法得出的结论可能欠准确。本项目也采取过提取石蜡组织RNA 分析miR-29c 表达，仅有部分组织能检测出miR-29c 表达，且CT 值均在32 以上，熔解曲线不理想（资料未发表）。

为了提高miR-29c 在胃癌组织中表达的检出率，本项目采用了ACD 公司推出的miRNAscope 技术。MiRNAscope 技术是一种专门为石蜡组织开发的原位杂交技术，与其他RNA 原位杂交方法相比，由于其独特的双Z 探针设计，信号放大倍数可达400 倍，并且同时进行背景噪声抑制［24］。应用这种方法使miR-29c 检出率显著提高，特异性更强，可以同时观察组织形态和信号表达。

本项目通过miRNAscope 技术对胃癌患者miR-29c 的检测及与临床因素的关系分析，发现miR-29c 在胃癌组织中的表达显著低于正常组织（P＜0.001），与TCGA 数据库分析结果相同，其表达的降低与胃癌患者病理分期、淋巴结转移、组织学分型显著相关（P值均＜0.001），与其他研究者的结论一致［25］，这些研究结果表明miR-29c 有可能成为胃癌的诊断、预后生物标志物及治疗靶点。本研究通过对miR-29c 的潜在靶基因进行富集分析，发现miR-29c 可能具有DNA 甲基化活化、干扰相关蛋白合成等生物学功能，参与PI3K-AKT 等信号通路的激活。miR-29c 参与的这些细胞功能及信号通路已有许多得到了文献证实［6，26-28］，但是本研究仍有部分局限性，仅从组织学层面证明miR-29c 表达与临床病理特征的密切关系，未能从细胞层面进一步探讨其作用机制。

总之，miRNAscope 技术能更灵敏地检测石蜡组织中的微量miRNA 的表达，miR-29c 在胃癌组织中低表达，与患者TNM 分期、淋巴结转移、组织学分型显著相关，miR-29c 可能参与胃癌发生发展，进一步的深入研究或能证实miR-29c 可成为胃癌患者诊断、预后的标记物及潜在的分子治疗靶点。

作者贡献度说明：

黄幼生：设计研究思路，张永芳：完成实验，撰写论文，李京城：分析数据，解娜：参与研究思路和稿件撰写，黄幼生、陈艳、陈俊明：帮助修改文章。

所有作者不存在利益冲突。

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