干细胞源性细胞外囊泡在修复椎间盘退变中的研究进展

黄子宇 赵必增

腰背痛是临床常见的一类肌肉骨骼症状，该症状与椎间盘退变（IDD）密切相关[1]。椎间盘是位于椎体之间的复杂结构，包括髓核、纤维环和软骨终板，这种独特的结构使脊柱具有弯曲能力和减震性能。随着IDD 的进展，髓核和纤维环的抗压结构和抗压能力发生退变。当前针对IDD 的常见疗法有手术治疗和保守治疗，手术治疗主要包括髓核摘除和椎间融合术，但都只能缓解IDD临床症状却无法干预IDD 的进程，寻找更为有效的延缓甚至逆转IDD 进程的治疗方案是有潜力的研究方向。随着干细胞研究不断的深入，从细胞上清液中分离获取的干细胞源性细胞外囊泡已成为干细胞潜在的替代品。许多研究发现，干细胞源性细胞外囊泡可促进血管再生，减轻炎症反应，抑制凋亡。因此，干细胞源性细胞外囊泡在延缓IDD 方面也受到了越来越多的关注。本文就干细胞源性细胞外囊泡在IDD 中的研究进展和应用前景进行综述。

1.1 IDD 病理机制

椎间盘由髓核和纤维环组成，是脊柱的承重和缓冲单元。髓核细胞位于内盘，主要产生细胞外基质及维持其平衡。当机体发生IDD 变时，髓核中蛋白多糖含量减少，髓核胶样物质脱水，导致髓核和纤维环的抗压结构异变和抗压能力下降[2]。研究认为，IDD 进展包括髓核细胞消耗和细胞外基质降解，软骨终板对纤维环内层和髓核细胞营养供应减少[3-4]。

1.2 IDD 当前的治疗

目前临床上IDD 常规治疗方法有保守治疗和手术治疗，如果保守治疗不能缓解疼痛且达到手术指征，可以考虑手术。然而，脊柱融合术、椎间盘摘除术等外科手术是侵入性的，通常需要较长的术后恢复时间且可能出现手术并发症，术后复发率也较高[5]。药物治疗和手术治疗只能缓解腰疼症状，未能从根本上延缓IDD 的进程。因此，许多研究集中于促进椎间盘再生，治疗方法包括生长因子疗法、基因疗法和干细胞疗法。

生长因子疗法是将生长因子直接注射到椎间盘中，从而促进细胞外基质合成，或延缓抑制炎症反应变性。目前常应用的生长因子有骨形态发生蛋白（BMP）和转化生成因子（TGF）-[6]。生长因子疗法的主要局限性是生物半衰期短，只有数小时或数天，且生长因子在恶劣的退变椎间盘微环境中很难维持活力，这些都限制了生长因子在IDD 治疗中的应用。

基因疗法则是通过载体将修复基因转染至椎间盘内的髓核、终板、纤维环细胞中，或将细胞取出，改变其特定的基因，再重新植入椎间盘内。一旦基因成功转染到靶细胞上，延缓IDD 的效果将长期存在。然而，基因治疗涉及遗传物质主动转移，通常使用病毒载体，存在发生病毒突变、全身病毒感染、免疫反应等病毒相关并发症的风险。

干细胞疗法是将各种干细胞注射到退化的椎间盘中，通过移植干细胞增殖、分化来调控和平衡椎间盘内环境，促进椎间盘再生。目前用于治疗IDD 的干细胞有脂肪源性干细胞（ADSC）、骨髓间充质干细胞（BMSC）、髓核间充质干细胞、脐带间充质干细胞及肌肉源性干细胞等[7-8]。BMSC即使在不利条件下也能够保持显著的高生存能力，是目前用于IDD 干细胞疗法中最常用的干细胞[9]。研究显示，BMSC 可抑制细胞凋亡水平，从而改善椎间盘变性[10]。Zhou 等[11]将BMSC、ADSC 和纤维环细胞进行共培养处理，结果表明Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原及蛋白聚糖在BMSC、ADSC 中均表达上调，且可分化为纤维环样细胞，但BMSC 修复纤维环的效果优于ADSC。然而，随着IDD 的发展，椎间盘中所含的干细胞数量和迁移能力都因退化椎间盘微环境恶化而下降[12]。此外，椎间盘微环境与干细胞所需的生长环境有很大不同[13]，导致移植细胞在退化椎间盘恶劣微环境中缺乏完全的再生反应，难以生存，酸性pH[6]和高渗[14]会严重损害细胞活力和表型。

越来越多的研究表明，干细胞延缓IDD 进展的功能大部分是通过旁分泌途径实现[8]，而干细胞源性细胞外囊泡是旁分泌途径的重要组成部分，它们是源自于供体干细胞释放的由脂质双分子层构成的纳米颗粒，其中含有多种生物活性物质（包括蛋白质、脂质、DNA、RNA 等）[15]。干细胞源性细胞外囊泡在髓核再生和椎间盘微环境稳态维持中具有重要作用[16]，如抑制髓核细胞凋亡、热解、异常神经侵袭，促进血管生成、细胞外基质合成及髓核细胞增殖和自噬，减轻炎症反应，从而抑制或延缓IDD。

2.1 细胞外囊泡特性与功能

细胞外囊泡包括小细胞外囊泡和微囊泡等。小细胞外囊泡是作为细胞之间通讯的关键信使，包含多种功能蛋白、miRNA、mRNA 及信号脂质等[17]。小细胞外囊泡直径一般为30～150 nm，且具有性质稳定、易获取、易保存、易转化、无免疫原性等特点。

脂质、蛋白质与核酸是细胞外囊泡的主要功能成分。脂质主要位于囊泡膜上，包括胆固醇、磷脂酰丝氨酸、鞘磷脂等。除了维持小细胞外囊泡的生物稳定性外，脂质还参与了小细胞外囊泡的形成和释放等生物过程[18]。小细胞外囊泡还富含各种蛋白质，包括细胞骨架成分、四环素、热休克蛋白及其他类型的蛋白质[19]。其中，Alix 和Tetraspanin 蛋白如CD81、CD9 和CD63 是小细胞外囊泡的标记[20]。小细胞外囊泡可通过与细胞膜融合，将其携带的功能核酸、脂质、蛋白质等传递到受体细胞，进而引起受体细胞功能、活性改变，促使细胞间的物质交换与信息交流[21-22]。鉴于小细胞外囊泡的功能与优势，注射携带有特定基因及治疗药物的小细胞外囊泡可能成为延缓IDD 的治疗手段[23]。

2.2 干细胞源性细胞外囊泡延缓IDD 的机制

2.2.1 促进基质合成

Xiang 等[24]将源自人尿源性干细胞来源的小细胞外囊泡与退变的髓核细胞进行共培养处理，结果表明随着共培养时间延长，细胞增殖显著增加；
细胞外基质中蛋白聚糖、Ⅱ型胶原表达水平与共培养时间呈正相关，而与退变相关的基质金属蛋白酶（MMP）表达水平与培养时间呈负相关，提示BMSC 衍生的小细胞外囊泡可起到促进髓核细胞增殖、维持细胞外基质平衡的作用。

Zhang 等[25]研究证实，经含miR-15a 的小细胞外囊泡处理的髓核间充质干细胞可上调蛋白聚糖、Ⅱ型胶原mRNA 和蛋白水平，同时下调血小板反应蛋白解整合素金属肽酶（ADAMTS）4/5、MMP-3/13 mRNA 和蛋白水平，通过磷酯酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）和Wnt3a/ -连环蛋白轴下调MMP-3 促进髓核间充质干细胞软骨分化。

退行性椎间盘组织中的自噬功能障碍是细胞死亡的主要原因，而自噬是调节椎间盘细胞间基质代谢的重要途径[26]。研究证实，自噬激活可以促进髓核细胞衍生的细胞外囊泡释放，从而防止髓核细胞基质降解；
自噬激活可通过携带miR-27a的小细胞外囊泡延缓IDD 进程，其在白细胞介素（IL）-1 刺激下可抑制MMP-13 表达[27]。

2.2.2 减轻细胞凋亡反应

终板软骨细胞凋亡和钙化可导致椎间盘内营养转运障碍，加重椎间盘变性，间充质干细胞衍生的小细胞外囊泡可显著降低终板细胞凋亡蛋白caspase-3、caspase-7、caspase-9、Runt 相关转录因子-2（Runx2）等因子表达水平，其潜在机制可能与miR-31-5p/活化转录因子（ATF）6/内质网（ER）应激途径调节有关[28]。

Zhu 等[29]研究发现，BMSC 衍生的小细胞外囊泡通过靶向混合谱系酶3（MLK3）传递miR-142-3p 来抑制髓核细胞的凋亡。Yuan 等[30]研究发现，人脐带间充质干细胞衍生的小细胞外囊泡通过靶向甲基转移酶样14(METTL14)有效提高髓核细胞的活力并避免焦亡。METTL14 在IDD 患者髓核细胞中高度存在，其以胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP）-2 依赖性方式稳定NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白（NLRP）3 mRNA。升高的NLRP3水平导致IL-1 和IL-18 水平上调，并引发髓核细胞死亡。这种致病轴可能被人脐带间充质干细胞衍生的小细胞外囊泡阻断，小细胞外囊泡携带的miR-26a-5p 可以直接降解METTL14。

Cheng 等[31]研究发现，BMSC 衍生的小细胞外囊泡可有效抑制肿瘤坏死因子（TNF）- 诱导髓核细胞的凋亡过程，这可能与其小细胞外囊泡携带的miR-21 经PI3K/Akt 信号通路靶向磷酸酶与紧张素同系物（PTEN），从而转入髓核细胞相关。

2.2.3 抑制炎症反应

作为椎间盘变性的征兆之一，炎症总是伴随着促炎因子的释放，它是导致椎间盘源性疼痛的关键因素。炎症因子如TNF- 、IL、一氧化氮和前列腺素E2 的相互作用和异常表达可引起炎症并加速IDD[32]。随着炎症反应的进展，来自背根神经节的免疫细胞和疼痛感应神经纤维开始浸润受损的椎间盘组织。一旦髓核细胞和免疫细胞开始释放神经营养因子，疼痛的神经纤维就会受到刺激并开始传递疼痛。此外，炎症因子还可以加速细胞衰老及细胞凋亡，促进细胞外基质降解蛋白表达，并抑制细胞外基质结构分子表达以增强退行性 过程[33]。

Cui 等[34]研究发现，miR-129-5p 在IDD 髓核组织中表达下调；
干细胞源性细胞外囊泡通过将所含的miR-129-5p 递送到髓核细胞抑制髓核细胞凋亡和细胞外基质降解，同时降低巨噬细胞M1 型极化程度。

此外，小细胞外囊泡可抑制H2O2诱导髓核细胞炎症因子如IL-6、一氧化氮合酶（NOS）表达，从而在减轻炎症反应方面发挥重要作用[35]。高级糖基化终产物（AGE）与炎症、代谢功能障碍和ER 应激密切相关，通常积聚在衰老和退行组织中，尤其是在富含胶原蛋白的组织中，AGE 积累可促进C/EBP 同源蛋白（CHOP）表达和髓核细胞受损[36]。Liao 等[37]通过AGE 诱导人髓核细胞引发ER 应激，间充质干细胞衍生的小细胞外囊泡通过激活Akt和细胞外调节蛋白激酶（ERK）信号转导来减弱ER 应激诱导的细胞凋亡，改善未折叠的蛋白质反应（UPR）过度激活，并降低CHOP 表达，从而使髓核细胞最终免受过度凋亡。研究发现，过度氧化应激及炎症反应是导致IDD 症状发生的早期事件，NLRP3 炎性小体则是导致氧化应激、炎症反应的重要因素，小细胞外囊泡通过抑制炎症介质和NLRP3 炎症小体活化，在病理性髓核细胞中起抗炎作用[35,38]。

此外，退变椎间盘内巨噬细胞表型或功能变化可直接导致微环境稳态破坏和炎症因子聚集，最终导致细胞外基质和椎间盘降解。M1 型巨噬细胞可以分泌大量的炎症因子如TNF- 、IL-1 等，它们会招募更多的巨噬细胞，导致椎间盘持续处于炎症状态，无法进入组织修复期[39]。相反，M2型巨噬细胞具有很强的吞噬能力，可以促进伤口愈合和组织修复[40]。Cui 等[34]研究发现，间充质干细胞衍生的小细胞外囊泡可递送miR-129-5p 并靶向LGR1基因，随后抑制p38 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的激活，使巨噬细胞向M1型极化，从而缓解IDD 进展。

2.3 存在的问题

在小细胞外囊泡应用于治疗IDD 时，小细胞外囊泡快速清除和破坏是2 个主要问题。此外，小细胞外囊泡治疗剂的开发方面仍面临着诸多挑战，目前小细胞外囊泡制剂生产受到了异质性、低生产率等的限制，因此需开发及优化生产细胞外囊泡制剂的方法[41]。同时，给药方式对于小细胞外囊泡的应用也很重要，给药方式包括系统注射和局部注射。单次注射可能无法确保长期缓解退变过程，而重复注射可能会破坏椎间盘结构。因此，寻找合适的小细胞外囊泡载体可能是未来的热门研究。目前已有关于小细胞外囊泡与生物材料结合应用于IDD 治疗的相关研究。Xing 等[3]将一种热敏无细胞外基质水凝胶与ADSC 衍生的小细胞外囊泡结合，该复合物兼具髓核组织与ADSC 的特性，可改善IDD，但仍需要大量的动物和临床实验佐证。

干细胞及其细胞外囊泡治疗IDD 可延缓症状。IDD 进程中伴随着髓核细胞功能退化，移植健康且具有活力的干细胞可通过多种途径恢复髓核细胞的活性。但由于退化椎间盘中恶劣的微环境，移植间充质干细胞的存活和分化仍存在一些问题。致瘤性、异位骨化、免疫反应等并发症限制了干细胞组织工程疗法应用的普及。细胞外囊泡由于不是细胞，没有相关的免疫反应、肿瘤形成和基因突变的风险，且保留了其来源细胞原本的特性，因此干细胞源性细胞外囊泡治疗IDD 有可能优于干细胞疗法[42-43]，但其存在有提取率低、量较少等问题[44]，未来的研究应侧重于改进分离和富集技术，制定标准化程序，从而大规模生产干细胞源性细胞外囊泡。

猜你喜欢外囊胞外基质充质细胞外囊泡在肺炎中作用机制及其诊疗研究医学信息(2023年5期)2023-04-15根治性肝切除与外囊摘除治疗肝包虫的临床疗效及并发症对比中国典型病例大全(2022年9期)2022-04-19金葡菌和大肠埃希菌细菌外囊泡的生物学特性比较研究解放军医学院学报(2022年12期)2022-02-21脱细胞外基质制备与应用的研究现状感染、炎症、修复(2021年1期)2021-07-28miR-490-3p调控SW1990胰腺癌细胞上皮间充质转化昆明医科大学学报(2021年3期)2021-07-22间充质干细胞外泌体在口腔组织再生中的研究进展昆明医科大学学报(2021年5期)2021-07-22间充质干细胞治疗老年衰弱研究进展现代临床医学(2021年2期)2021-03-29三七总皂苷对A549细胞上皮-间充质转化的影响世界科学技术-中医药现代化(2021年10期)2021-03-02关于经络是一种细胞外基质通道的假说世界科学技术-中医药现代化(2020年2期)2020-07-25细胞外囊泡及其在创伤性颅脑损伤诊疗中应用的研究进展▲广西医学(2020年1期)2020-03-03