温和灸联合间充质干细胞移植对大鼠肛门括约肌损伤的修复作用及其机制

金文琪，郭修田，朱 影，李 鹏，李小嘉(上海市中医医院肛肠科，上海 200071;通讯作者，E-mail:guoxiutian@126.com)

肛门括约肌损伤会造成机体对液体、固体及气体的控制能力降低或丧失，导致排便能力失调[1]。大便失禁的原因与神经元损伤及肌源性损伤相关，其中肛门括约肌损伤是导致其形成的最主要的原因，给患者带来较大痛苦，显著降低患者生活质量[2]。肛门括约肌损伤的形成与多种因素存在相关性，其中Wnt信号通路表达异常是其中之一，Wnt在动物胚胎形成、器官形成及组织再生中均发挥关键作用。在先天性肛门直肠畸形中存在Wnt5a功能丧失，可影响生殖结节的形成，原因可能与β-catenin表达降低相关[3]。Wnt3a作为Wnt/β-catenin信号通路中经典调控途径的代表，在直肠畸形大鼠中表达显著低于健康大鼠，提示Wnt3a表达缺失可能加快疾病发生发展[4]。目前，对于大便失禁的治疗方法多集中在饮食、药物、盆底神经刺激及手术治疗等，但是复发率仍然较高，因此探寻一种新的治疗方法对于提高临床疗效具有重要意义。

温和灸是一种传统的中医理疗手段，是通过将点燃的药物放置到人体肌肉表层，热量输入引起机体自我调节，达到疏通脏腑，平衡阴阳的作用。温和灸可提高大鼠肛瘘术后感染性创面局部微循环，可调节血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达而加快创面愈合[5]。目前，间充质干细胞对肛门括约肌的修复引起了肛肠学者的重视。动物模型证实，骨髓间充质干细胞(bone manrrow mesenchymal stem cells，BMSCs)注射可以促进损伤大鼠肛门括约肌修复，改善括约肌收缩功能[6]。已有研究表明，温和灸联合BMSCs可以改善肛门括约肌损伤，可为临床肌源性大便失禁的治疗提供参考方向[7]。但是能否通过调节Wnt信号通路而发挥抑制肛门括约肌损伤的作用目前尚无定论，本文观察温和灸联合间充质干细胞移植对大鼠肛门括约肌损伤修复及Wnt信号通路的影响，旨在为相关研究提供参考依据。

1.1 实验大鼠

54只6～8周龄雌性及2只雄性SD大鼠，SPF级，购自广东省医学实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)2019-003l，体质量200～250 g，饲养室内温度22 ℃，相对湿度50%～65%，自由饮水及摄食，适应周围环境7 d后进行后续实验。本研究通过本院伦理委员会批准(2021-0020)。

1.2 主要仪器与试剂

IX83倒置显微镜(奥林巴斯(中国)有限公司)；
RM2235石蜡切片机(德国Leica公司)；
FA1204B电子分析天平(上海天美天平仪器有限公司)；
李时珍蕲艾条(1.8 cm×20 cm，佛山市艾传医疗器械有限公司)；
-80 ℃低温冰箱(上海赛弗生物科技有限公司)。Wnt3a、Wnt5a抗体(上海华雅思创生物科技有限公司)；
β-连环蛋白(β-catenin)单抗(北京博奥森生物技术有限公司)；
苏木素-伊红试剂盒(南京生航生物技术有限公司)；
BCA蛋白定量试剂盒(美国Thermo Scientific公司)。

1.3 分组及处理

参考Zusthi模型[8]建立大鼠肛门括约肌损伤模型，对于大鼠均腹腔注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)，在解剖显微镜下逐层分离大鼠腹腔，纵向切开大鼠括约肌，每只大鼠切除部位一致，术后压迫止血，0.5 mg/kg的布比卡因镇痛。建模成功标准参考文献[8]，大便排便次数增多，质稀不成形，甚至大便失禁，证实造模成功。

50只大鼠被随机分为假手术组、模型组、温和灸组、BMSCs组、温和灸+BMSCs组，每组10只。温和灸组：将点燃的蕲艾条放置于距大鼠肛门约2 cm处，温和灸大鼠肛门局部创面，治疗15 min，从造模后第1日开始，每日1次，连续7 d。BMSC组：在大鼠括约肌损伤处及缺损两侧断端边缘直接注射约含1×107个BMSCs，共0.3 ml，每个部位0.1 ml。温和灸+BMSC组：在大鼠括约肌损伤处基底部及两侧断端各注射0.1 ml PBS(共0.3 ml PBS，含107个BMSCs)，然后将点燃的艾条直对干细胞注射处(即括约肌损伤处)进行治疗，时间15 min，每日1次，连续7 d。模型组注射部位同BMSC组，注射等体积的生理盐水；
假手术组不做处理。

1.4 大鼠BMSCs的分离及培养

4只雌性大鼠及2只雄性大鼠，按照2 ∶1的比例合笼后，妊娠成功，饲养小鼠体质量50 g时，提取雄性小鼠间充质干细胞。将雄性小鼠处死后取股骨，采用0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)冲洗干净，PBS再次冲洗2次，采用细胞滤膜过滤细胞，加入0.25%胰蛋白酶1 ml消化，采用显微镜观察细胞形态，加入1 ml DMEM高糖完全培养基(含10% FBS)中吹打细胞20次。细胞按照1 ∶2传代，采用200g离心细胞悬液，细胞沉淀物采用0.01 mol/L PBS重悬，采用流式细胞仪鉴定细胞。

1.5 大鼠肛门括约肌功能检测

分别于治疗结束后7，14，21 d进行静息压、收缩压与肌电振幅、肌电频率检测。采用多道信息采集处理系统的不同检测模块，记录并分析不同时间节点各组的功能指标。在大鼠腹腔注射麻醉后，将1个特制的球囊润滑后完全放入大鼠肛内以进行括约肌压力检测，球囊插入深度为球囊淹没后0.5 cm，球囊连接注射器与采集处理系统，每次注水0.8 ml扩张球囊以检测肛压。选取压力通道，设置参数后每只大鼠检测时间为波形稳定后15 min。保存所有文件，分别选取稳定波峰及基线值记录为收缩压与静息压。检测肌电，将两只30号US53153型同轴电针分别插在大鼠肛门3、9点位，深度约0.4 cm，电极夹连接采集系统，选取生物肌电模式进行检测。设置参数后每只大鼠检测时间为波形稳定后15 min。保存所有采集文件，为了定量尿道括约肌肌电图(arethral sphincter electromyography，US-EMG)动作电位的振幅和频率，在每个节点的检测波形中随机计算平均值，5 s一次，连续5次，并设定一个高于噪音但低于动作电位的临界值以定量动作电位的频率。统计波形穿过此阈值的动作电位的振幅和频率。

1.6 组织分离及苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining，HE)染色

腹腔麻醉颈部脱臼处死，消毒肛周后迅速剥离肛门括约肌(距离肛缘0.5～1 cm)，浸泡于4%聚四氟乙烯中，4 ℃过夜固定，脱钙剂浸泡1周左右，10%的甲醛溶液中，固定过夜，自来水冲洗，浸泡于14%的乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid， EDTA)溶液中脱钙，逐级脱水后石蜡包埋，4 μm切片。组织切片放入37 ℃复温15 min，二苯甲脱蜡后按照100%→95%→85%及75%乙醇进行逐级脱水，苏木精染色10 min，1%盐酸处理，伊红复染，100%→95%→85%及75%乙醇脱水，封片。光镜观察组织形态。

1.7 免疫组化检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)阳性细胞数

肛门括约肌组织石蜡切片，常规脱蜡脱水后，采用PBS冲洗3次，间隔5 min，37 ℃用羊血清封闭60 min，加入α-SMA(1 ∶500)一抗，4 ℃孵育24 h，加入二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(1 ∶1 000)，孵育30 min，冲洗后加入50 μl的链霉亲和素-生物素复合物，二氨基联苯胺显色，冲洗，终止显色，透明、封片，选择选取5个非重叠视野，计算阳性细胞数，细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞。

1.8 免疫印迹检测Wnt3a、Wnt5a、β-catenin蛋白水平

肛门括约肌组织采用PBS冲洗后切碎，采用细胞裂解液，按照10 000g离心10 min，4，4’-二羧-2，2’-二喹啉(bicinchoninc acid procedure，BCA)法检测蛋白水平，加入20 μg蛋白样品，聚丙烯酰胺凝胶电泳，转印缓冲液低温预冷，转移到PVDF膜上，加入脱脂奶粉，封闭60 min。加入一抗Wnt3a(1 ∶1 000)、Wnt5a(1 ∶1 000)、β-catenin(1 ∶500)及GAPDH(1 ∶2 500)，磷酸盐溶液冲洗，加入抗兔IgG二抗(1 ∶2 500)，增强型化学发光(Enhanced ChemiLuminescence，ECL)系统JY-Clear分析蛋白值。

1.9 统计学分析

2.1 肛管收缩压和静息压比较

与假手术组相比，模型组治疗7，14，21 d时肛管收缩压和静息压均明显降低(P<0.05)；
与模型组相比，温和灸组治疗7，14，21 d时肛管收缩压与静息压升高(P<0.05)；
温和灸与BMSCs组治疗7，14，21 d时肛管收缩压和静息压比较差异无统计学意义(P>0.05)；
与BMSCs组相比，温和灸+BMSCs组治疗7，14，21 d时的肛管收缩压和静息压均升高(P<0.05，见表1)。肛管收缩压及肛管静息压不同时间点组间与时间存在交互作用(P<0.05，见表1)。

表1 各组大鼠不同时间点鼠肛管收缩压和静息压比较 (mmHg)Table 1 Comparison of anal systolic pressure and resting pressure of rats at different time points between groups (mmHg)

2.2 大鼠肌电振幅及肌电频率

与假手术组相比，模型组治疗7，14，21 d时肌电振幅及肌电频率均明显降低(P<0.05)；
与模型组相比，温和灸组治疗7，14，21 d时肌电振幅及肌电频率升高(P<0.05)；
温和灸与BMSCs组治疗7，14，21 d时的肌电振幅及肌电频率比较差异无统计学意义(P>0.05)；
与BMSCs组相比，温和灸+BMSCs组治疗7，14，21 d时肌电振幅及肌电频率均升高(P>0.05，见表2)。肌电振幅及肌电频率不同时间点组间与时间存在交互作用(P<0.05，见表2)。

表2 各组大鼠不同时间点肌电振幅及肌电频率的比较Table 2 Comparison of EMG amplitude and EMG frequency at different time points between groups

2.3 HE染色观察肛门括约肌病理形态

假手术组大鼠肛门括约肌肌纤维组织排列整齐，无炎症浸润；
模型组大鼠肌纤维组织结构紊乱，间隙增大，炎症浸润显著且括约肌出现一定程度萎缩；
与模型组相比，温和灸组及BMSCs组大鼠肛门括约肌肌纤维紊乱改善，间隙减小；
温和灸+BMSCs组肌肉纤维结构与假手术组相似(见图1)。

图1 HE染色观察大鼠肛门括约肌病理形态 (×200)Figure 1 Pathological morphology of anal sphincter in rats by HE staining (×200)

2.4 免疫组化检测肛门括约肌组织中α-SMA阳性细胞数

假手术组、模型组、温和灸组、BMSCs组及温和灸+BMSCs组的α-SMA阳性细胞数分别为(70.25±8.20)个、(24.23±1.33)个、(46.33±3.61)个、(47.20±3.55)个及(62.56±5.56)个，α-SMA阳性细胞数组间比较差异有统计学意义(P<0.05，见图2)。与假手术组相比，模型组α-SMA阳性细胞数降低(t=13.570，P<0.05)；
与模型组相比，温和灸组α-SMA阳性细胞数升高(t=14.070，P<0.05)；
温和灸与BMSCs组α-SMA阳性细胞数比较差异无统计学意义(t=0.905，P=0.387)；
与BMSCs组相比，温和灸+BMSCs组在α-SMA阳性细胞数升高(t=5.332，P=0.003)。

图2 温和灸及BMSCs处理对大鼠肛门括约肌组织中α-SMA阳性细胞数的影响 (×200)Figure 2 Effect of mild moxibustion and BMSCs on α-SMA positive cells in anal sphincter tissue in rats (×200)

2.5 免疫印迹检测各组大鼠肛门括约肌组织Wnt3a、Wnt5a、β-catenin蛋白水平比较

与假手术组相比，模型组Wnt3a、Wnt5a、β-catenin表达降低(t分别为7.177，15.280，18.130，均P<0.05)；
与模型组相比，温和灸组Wnt3a、Wnt5a、β-catenin表达升高(t分别为7.449，11.550，6.111，均P<0.05)；
温和灸与BMSCs组Wnt3a、Wnt5a、β-catenin表达比较差异无统计学意义(t分别为0.597，0.453，0.294，均P>0.05)；
与BMSCs组相比，温和灸+BMSCs组Wnt3a、Wnt5a、β-catenin表达升高(t分别为5.400，.289，3.408，P<0.05，见表3、图3)。

表3 各组大鼠肛门括约肌组织Wnt3a、Wnt5a、β-catenin蛋白水平Table 3 Protein levels of Wnt3a， Wnt5a and β-catenin in anal sphincter tissues of rats in each group

图3 温和灸及BMSCs处理因素对大鼠肛门括约肌组织中Wnt3a、Wnt5a、β-catenin蛋白表达的影响Figure 3 Effects of mild moxibustion and BMSCs on Wnt3a， Wnt5a β-Catenin protein expression

肛门括约肌主要受植物神经支配，可维持肛管静息压，当静息压大于肠道内压力时可控制肠内容物的排除，达到维持肛门自制的作用[9]。肛门括约肌损伤时静息压及收缩压均显著降低，部分患者括约肌长度缩短可导致直肠肛管抑制反射消失，导致大便失禁。括约肌肌电活性(包括振幅和频率)可作为反映肠道动力的客观指标，大便失禁大鼠肌电振幅及肌电频率均降低，表明大鼠肠道存在节律紊乱，产生原因可能在于肠道静息压及收缩压降低，导致肠道推进行收缩频率改变，影响肠道收缩能力，降低肌肉收缩，肠道损伤加重，导致大便失禁进展[10]。

本研究结果显示，与模型组相比，温和灸组、BMSCs组及温和灸+BMSCs组大鼠肛门括约肌收缩压、静息压、肌电振幅及肌电频率均提高，以温和灸+BMSCs组效果最佳，说明温和灸联合BMSCs治疗可提高括约肌功能而对大便失禁发挥治疗作用。中医学将大便失禁归属为“滑泄”或“大便滑脱”或“遗矢”范畴，发病机制多数与“脾肾亏虚”“气虚下陷”，故应该采用扶正祛邪、温通气血的温和灸可补虚化瘀、改善局部血液循环达到疾病治疗作用[11]。温和灸衍生于灸法，主要是通过温热柔和的刺激量发挥散寒通痹，补中益气，温阳固脱，升阳举陷的作用。临床研究表明，温和灸可以通过盆神经兴奋相关神经，促进腰骶部低级中枢与大脑皮层高级中枢建立良好的神经反馈通路，调节盆底肌的运动和肌力，可用于括约肌损伤的大便失禁患者临床治疗中，临床疗效较好[12]。近些年再生医学快速发展，生物学及工程学促使功能丢失的组织或器官重新获得功能，其中BMSCs是再生医学主要种子细胞，它具有多向分化潜能、自我更新能力、来源丰富、免疫原性低等特征，在衰老及组织损伤修复方面的应用十分广泛[13]。研究表明，在女性压力性尿失禁患者中采用BMSCs移植可修复受损的括约肌，增加括约肌肌张力从而提高尿控能力[14]。但经静脉注射移植的干细胞可能因外周血不能达到受损部位，故如何诱导其向特定部位迁移成为研究重点。本研究通过于括约肌损伤部分采用BMSCs注射后采用温和灸干预可加快BMSCs在损伤处的定植，而发挥改善损伤的作用。

本研究结果显示，与模型组相比，温和灸组、BMSCs组及温和灸+BMSCs组大鼠α-SMA阳性表达升高，以温和灸+BMSCs组效果最佳，说明联合治疗可以显著提高α-SMA表达进而改善括约肌损伤进而改善大便失禁。α-SMA是肌动蛋白之一，主要发挥肌肉收缩的作用，是肛门括约肌收缩成分肌丝的重要组成，其表达升高或降低可影响括约肌收缩及顺应性[15]。在括约肌损伤大鼠中α-SMA表达降低，可导致括约肌系统功能异常，发生盆底肌群紊乱，功能不良，从而造成大便失禁。以往的研究过程中认为BMSCs可以诱导分化为成纤维及肌成纤维细胞，而α-SMA则是肌成纤维细胞标志物，证实BMSCs可以通过上调α-SMA表达而预防纤维萎缩[16]。在压力性尿失禁相关研究中，上调BMSCs后可以显著升高平滑肌标志性蛋白α-SMA水平，证实了BMSCs可以向膀胱平滑肌细胞分化，这与组蛋白乙酰化相关[17]。温和灸通过将热量沿着经络传到损伤部分，可提高肌纤维的表达，α-SMA升高，增加大鼠环形肛门括约肌组织的愈合。在BMSCs注射后温和灸以其温热柔和的刺激量改善损伤，提高BMSCs细胞定植率，加之温和灸自身的温经散寒，化瘀散结的效果，共同发挥损伤创面的修复作用。

Wnt是一种进化保守的信号通路，信号通路包含Wnt3a、Wnt5a、β-catenin等组成。在损伤的肠上皮中认为激活Wnt/β-catenin信号通路可以提高辐射损伤后小鼠肠道肝细胞的存活，说明Wnt/β-catenin与肠道疾病存在关联。在先天性肛门直肠畸形患儿Wnt5a活性丧失会影响生殖结节的形成，导致其衍生物发育不全[18]。在正常大鼠直肠末端发现Wnt3a成强阳性表达，但是在肛门直肠畸形大鼠中表达降低，其缺失会抑制直肠神经肌肉及盆底发育，导致疾病发生发展[19]。本研究结果显示，与模型组相比，温和灸组、BMSCs组及温和灸+BMSCs组大鼠Wnt3a、Wnt5a、β-catenin表达升高，以温和灸+BMSCs组效果最佳，说明联合治疗可以显著提高Wnt3a、Wnt5a、β-catenin进而修复肠道损伤。但是目前在肛门括约肌损伤中关于温和灸、BMSCs对Wnt信号通路研究暂无文献，但是在其他疾病中已有证实。例如在脊髓损伤大鼠中温针灸头部腧穴可明显上调大鼠脊髓和端脑中Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白Wnt3a、β-catenin的表达，可以显著改善脊髓损伤[20]。在成骨细胞研究中认为辛伐他汀可以加快BMSCs细胞分化而增加成骨细胞活性，与激活Wnt3a表达相关[21]。本文研究认为温和灸可以加快BMSCs活性而改善肛门括约肌损伤，机制与上调Wnt表达相关，但是具体研究机制还需要进一步探讨。

本研究存在一定不足，时间及经费受限未进行更多的实验研究，可能对结果存在一定影响，今后应增加样本量，充实实验内容，为大便失禁的相关研究提供实验依据。

综上所述，温和灸联合骨髓间充质干细胞可以修复肛门括约肌损伤，通过增加肛管收缩压、静息压、肌电振幅及肌电频率而提高括约肌功能，增加α-SMA表达，预防纤维萎缩，其机制可能与激活Wnt信号通路相关。

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