沙蟾毒精通过Nrf2-HO-1/SLC7A11途径诱导人胃癌SGC-7901细胞铁死亡

王文君，刘霞霞，陈馨，程卉*，王国凯*（. 安徽中医药大学药学院，合肥 23002；
2. 新安医学教育部重点实验室，合肥 230038；
3. 安徽中医药大学科研技术中心，合肥 230038）

胃癌（gastric cancer，GC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，在消化道恶性肿瘤中排第二位，2020年新增100多万病例，有76.9万人死亡，发病率、病死率均较高[1]。多数患者确诊时已经处于GC中晚期，术后易复发转移[2]，化疗有助于延长患者的生存时间，提高患者的生活质量。然而，目前的化疗药物对GC的治疗效果十分有限[3-4]，因此亟待发掘新的化疗药物。

天然化合物沙蟾毒精（ArBu）是从中华大蟾蜍的蟾酥和蟾皮提取得到的一种新的潜在抗肿瘤成分[5]，分子式为C24H32O6，分子量为416.5，目前已有诸多研究发现ArBu具有广谱抗肿瘤活性，主要通过诱导细胞凋亡、抑制血管生成以及肿瘤细胞的黏附、迁移和侵袭发挥作用[6-8]。

铁死亡（ferroptosis）是一种依赖于铁代谢的新的程序性细胞死亡方式，即在二价铁或脂氧合酶的作用下，催化细胞膜上高表达的不饱和脂肪酸，使活性氧（reactive oxygen species，ROS）积聚导致脂质过氧化，从而诱导细胞死亡[9-11]。越来越多的天然化合物被发现能通过铁死亡途径发挥抗肿瘤作用[12]，但未见研究报道ArBu诱导GC细胞铁死亡。核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是控制细胞氧化还原、动态平衡和炎症的关键转录因子，与铁死亡氧化应激通路密切相关，Nrf2可以通过调控血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）和溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）诱导铁死亡[13-14]。因此，本研究旨在观察ArBu是否能诱导人胃癌细胞系SGC-7901细胞发生铁死亡，并探讨其机制。

1.1 肿瘤细胞

人胃癌细胞SGC-7901（中国科学院上海细胞库），在含10%胎牛血清，1%青霉素链霉素混合液的RPMI-1640培养基中于37℃，5%CO2的条件下培养。

1.2 仪器

酶标仪（美国MD公司，iD3）；
细胞培养箱（美国Thermo Fisher公司，BB150）；
生物安全柜（浙江苏净净化公司，BSC-1000ⅡA2）；
离心机（德国Eppendorf公司，5418R）；
显微镜（德国徕卡公司，DMI6000B）；
透射电镜（日本日立公司，Hitachi-600）；
蛋白电泳及转印系统（美国伯乐公司，Mini-PROTEAN）；
流式细胞仪（美国Beckman公司，FC500）；
凝胶成像仪（广州博鹭腾生物科技有限公司，GelView6000Plus）。

1.3 试药

ArBu[安徽华润金蟾药业股份有限公司提供，纯度为94.1%，CAS：464-74-4，用二甲基亚砜（DMSO）（终浓度＜0.1%）助溶后加入 RPMI-1640培养液配制]；
Fer-1（批号：#28329，规格：10 mmol·L-1×1 mL，MedChemExpress公司），CCK-8试剂盒（批号：2J226，麦客生物有限公司），谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒（批号：20220513）、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（批号：20211124）、丙二醛（MDA）检测试剂盒（批号：20210923）（南京建成科技有限公司），脂质ROS检测试剂盒（批号：2011556，Thermo Fisher Scientific公司），BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号：092721220221，碧云天生物技术有限公司），细胞Fe含量检测试剂盒（批号：BC5310，北京索莱宝公司），Nrf2抗体、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）抗体（Cell Signaling Technology公司），SLC7A11抗体、铁蛋白重链1（FTH1）抗体（Affinity Biosciences公司），HO-1抗体、β-actin抗体、二抗（正能生物技术有限责任公司），ECL显影发光液（批号：22182599，兰杰柯科技有限公司）。

2.1 CCK-8法检测细胞增殖

将SGC-7901细胞接种到96孔板中培养过夜，每孔100 μL（5×103个），每组6个复孔，第2日将原培养基吸出，加入不同浓度的药物培养基（0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μmol·L-1ArBu，5 μmol·L-1Fer-1，0.4 μmol·L-1ArBu+5 μmol·L-1Fer-1）的培养基100 μL继续培养24 h和48 h。每孔加入CCK-8试剂10 μL，继续在培养箱里避光培养2 h。用酶标仪在450 nm波长处测定每孔的吸光度值A，用不含细胞的培养基来校正。将细胞存活率输入GraphPad 6.0 Prism 8.0.2计算IC50。细胞存活率（%）＝[（A药物-A空白）/（A对照-A空白）]×100%。

2.2 显微镜和透射电镜观察细胞及线粒体形态变化

将细胞分为对照组（含同浓度DMSO）、ArBu中浓度组（0.4 μmol·L-1）和ArBu联合Fer-1组（0.4 μmol·L-1+5 μmol·L-1）。细胞处理24 h后，分别用显微镜（×200）和透射电镜（×7000）观察细胞及线粒体形态变化。

2.3 GSH、SOD、MDA和总Fe水平的测量

将细胞分为对照组（含同浓度DMSO），ArBu低、中、高浓度组（0.2、0.4、0.8 μmol·L-1）和ArBu（0.4 μmol·L-1）联合Fer-1（5 μmol·L-1）组。细胞处理24 h后，将SGC-7901细胞用胰酶消化收集于PBS中，并于4℃条件下超声破碎成细胞匀浆，按照试剂盒说明书操作，检测GSH、SOD、MDA和总Fe水平。用BCA法对细胞的蛋白水平进行定量。

2.4 脂质ROS水平的测量

细胞分组同“2.3”项下。细胞处理24 h后，弃去含药培养基，加入含有C11-BODIPY581/591荧光探针的培养基，37℃避光孵育30 min，弃去培养基，用无血清培养基洗涤3次，收集细胞后用流式细胞仪检测荧光强度。

2.5 Western blot检测蛋白表达

将细胞分为对照组（含同浓度DMSO）、ArBu低、中、高浓度组（0.2、0.4、0.8 μmol·L-1），细胞处理24 h后收集细胞，提取总蛋白，BCA法进行蛋白定量，加入 5×loading buffer，100℃金属浴煮沸10 min使蛋白变性。采用SDS凝胶电泳将蛋白质分离，上样10 μL蛋白样品，电泳转移至硝酸纤维素膜上。5%脱脂牛奶封闭2 h，孵育相对应的一抗（1∶1000），4℃过夜，二抗（1∶10 000）室温孵育2 h。ECL显影发光液显色，凝胶成像仪拍照，Image J 6.0软件分析条带灰度值，计算相对表达量（%）＝（目标蛋白÷参比蛋白β-actin的灰度值）×100%。

2.6 统计学处理

定量研究结果采用GraphPad Prism 8.0.2软件进行分析并作图。所有实验都至少重复了3次。数据比较采用单因素方差分析（One-way，ANOVA）和Dunnett’s检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3.1 ArBu抑制SGC-7901细胞增殖

ArBu处理SGC-7901细胞24 h和48 h的细胞存活率结果见图1。与对照组相比，SGC-7901细胞的存活率随着ArBu的浓度增大和处理时间的延长逐渐降低，24 h和48 h 的IC50值分别为0.46 μmol·L-1和0.26 μmol·L-1。因此，选择0.2、0.4、0.8 μmol·L-1作为ArBu低、中、高浓度进行后续实验。此外，与0.4 μmol·L-1ArBu处理组相比，ArBu联合Fer-1组（0.4 μmol·L-1+5 μmol·L-1）细胞存活率明显升高（P＜0.01），说明ArBu抑制SGC-7901细胞增殖确实有铁死亡参与，且Fer-1能部分逆转铁死亡所导致的细胞增殖的抑制。

图1 ArBu对SGC-7901细胞存活率的影响Fig 1 Effect of ArBu on cell viability of SGC-7901 cells

3.2 细胞形态变化

ArBu处理SGC-7901细胞24 h后，与对照组相比，ArBu中浓度组（0.4 μmol·L-1）的细胞和线粒体失去正常形态，明显变形皱缩，线粒体嵴消失，线粒体和部分细胞死亡；
与0.4 μmol·L-1ArBu处理组相比，ArBu联合Fer-1组（0.4 μmol·L-1+5 μmol·L-1）与对照组细胞形态无明显差异，线粒体并未皱缩变小（见图2）。

图2 显微镜（×200）和透射电镜（×7000）下0.4 μmol·L-1 ArBu以及联合5 μmol·L-1 Fer-1处理SGC-7901细胞24 h后的细胞和线粒体形态图Fig 2 Morphology of cells and mitochondria of SGC-7901 cells treated with 0.4 μmol·L-1 ArBu or combined with 5 μmol·L-1 Fer-1 for 24 h under microscope（×200）and transmission electron microscope（×7000）

3.3 ArBu对SGC-7901细胞GSH、SOD、MDA和总Fe水平的影响

ArBu处理SGC-7901细胞24 h后，与对照组相比，细胞内GSH和SOD水平明显降低（P＜0.01），MDA和总Fe水平明显升高（P＜0.05，P＜0.01），且都呈现出浓度依赖性；
与0.4 μmol·L-1ArBu组相比，ArBu联合Fer-1组（0.4 μmol·L-1+5 μmol·L-1）细胞内GSH和SOD水平显著升高（P＜0.05），MDA和总Fe水平显著降低（P＜0.01）（见图3）。

图3 ArBu对SGC-7901细胞GSH、SOD、MDA和总Fe水平的影响Fig 3 Effect of ArBu on GSH，SOD，MDA and total Fe levels in SGC-7901 cells

3.4 ArBu对SGC-7901细胞脂质ROS水平的影响

ArBu处理SGC-7901细胞24 h后，与对照组相比，峰显著右移，荧光更强，且呈浓度依赖性，与0.4 μmol·L-1ArBu组相比，ArBu联合Fer-1组（0.4 μmol·L-1+5 μmol·L-1）峰明显左移，荧光较弱（见图4A）。细胞内脂质ROS水平变化见图4B，与对照组相比，ArBu处理组细胞内脂质ROS水平明显升高（P＜0.01），且呈浓度依赖性。与0.4 μmol·L-1ArBu组相比，0.4 μmol·L-1ArBu联合Fer-1（5 μmol·L-1）组细胞内脂质ROS水平显著降低（P＜0.05）。

图4 ArBu对SGC-7901细胞脂质ROS水平的影响Fig 4 Effect of ArBu on lipid ROS levels in SGC-7901 cells

3.5 ArBu对SGC-7901细胞Nrf2-HO-1/SLC7A11途径相关蛋白表达的影响

与对照组相比，ArBu处理SGC-7901细胞24 h后，Nrf2、HO-1、SLC7A11、FTH1和GPX4的表达水平均降低（P＜0.05），且呈浓度依赖性（见图5）。说明ArBu能通过Nrf2-HO-1/SLC7A11途径诱导SGC-7901细胞铁死亡。

图5 ArBu对SGC-7901细胞Nrf2-HO-1/SLC7A11途径相关蛋白表达的影响Fig 5 Effect of ArBu on the expression of Nrf2-HO-1/SLC7A11 pathway-related proteins in SGC-7901 cells

GC占全球新发肿瘤病例的6%，我国是GC患者最多的国家，在2020年有47.85万新发病例，37.38万死亡病例，占全球GC新发病例和死亡病例的44.0%和48.6%[1]。寻找有效、安全、低毒的抗GC药物已成为应对这一威胁的主要策略。

近年来越来越多的天然药物单体被发现有治疗GC的潜力。蟾蜍毒的主要活性成分ArBu是一种天然甾体化合物，已被证明能在体内外抑制多种细胞和肿瘤增殖，显示出了良好的广谱抗肿瘤活性。ArBu可作用于非小细胞肺癌（NSCLC）PC-9细胞和A549细胞，可引起染色质固缩、核碎裂和凋亡小体的形成[15-16]。ArBu还可通过干扰信号通路诱导细胞凋亡和抑制血管生成，Zhang等[17]发现ArBu能通过PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导肝癌细胞HepG2凋亡，Li等[18]发现通过VEGFR-2信号通路，ArBu可以抑制VEGF介导的血管生成，抑制血管内细胞迁移和侵袭以及人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的形成。本研究通过CCK-8法发现，ArBu能显著降低SGC-7901细胞的存活率且具有时间和浓度依赖性，24 h和48 h的IC50值仅为0.46 μmol·L-1和0.26 μmol·L-1，显示ArBu具有良好的抗肿瘤细胞活性。

铁死亡领域自从被发现以来就被联想到与肿瘤相关，铁死亡的化学诱导剂也是在寻找新的抗肿瘤化合物过程中发现的[19-20]。铁死亡的起始和执行与氨基酸、脂质和铁代谢调节都有联系，受到多种分子机制的调控。

当0.4 μmol·L-1ArBu与5 μmol·L-1铁死亡特异性抑制剂 Fer-1联用时，24 h和48 h的细胞存活率明显升高（P＜0.01），说明ArBu抑制SGC-7901细胞增殖可能与铁死亡相关。用显微镜和透射电镜观察细胞和线粒体的形态变化时发现，与对照组相比，ArBu处理SGC-7901细胞24 h后，细胞和线粒体明显变形皱缩，部分细胞死亡，线粒体嵴消失；
但当Fer-1联合ArBu处理SGC-7901细胞24 h，细胞形态与对照组无明显差异，线粒体并未皱缩变小；
并且氧化应激相关指标GSH、SOD、MDA、总Fe和脂质ROS的水平的变化，也证实了ArBu能诱导SGC-7901细胞发生铁死亡。

Nrf2是控制细胞氧化还原、动态平衡和炎症的关键转录因子，同时与铁死亡氧化应激通路密切相关，Nrf2作为转录因子促进SLC7A11和GPX4的表达，还调控下游的靶基因HO-1和FTH1[14，21-22]。GPX4对铁死亡起到至关重要的调控作用，GPX4和细胞膜上的胱氨酸/谷氨酸转运受体（System Xc-）以及各种铁死亡相关蛋白是通过影响ROS代谢发挥其功能的，GSH是GPX4催化脂质过氧化物还原过程的主要辅助因子[23]。System Xc-由SLC7A11和 SLC3A2组成，能够使细胞内谷氨酸和细胞外胱氨酸进行1∶1交换[24]，进入细胞内的胱氨酸可被还原成半胱氨酸，参与GSH的合成。抑制System Xc-会导致GSH耗竭并间接诱导GPX4失活，最终导致ROS聚集，诱发铁死亡[9]。Western blot结果显示，ArBu处理细胞24 h后，Nrf2、SLC7A11和GPX4的表达水平明显下降，可能是ArBu抑制了Nrf2的表达，Nrf2又下调了SLC7A11和GPX4的表达，而下调SLC7A11的表达会耗竭GSH，进一步抑制GPX4，GSH的试剂盒检测结果也显示ArBu能显著降低GSH水平。

HO-1是一种重要的抗氧化酶，主要催化血红素分解代谢成亚铁、一氧化碳和胆绿素：一方面，血红素基团的降解有利于阻止其促氧化作用；
另一方面，副产物胆绿素及其还原型胆红素具有有效ROS清除活性[25-27]。HO-1是细胞铁离子的重要来源，在铁死亡诱导剂erastin诱导的细胞死亡中，可以使膜脂质过氧化诱导细胞发生铁死亡[28]。铁蛋白轻链（FTL）和FTH1可以将细胞中多余的铁储存在胞质中[29]，FTL和FTH1的失活会导致细胞内铁离子浓度因代谢失衡而升高。本研究结果显示ArBu处理细胞24 h后，HO-1和FTH1的表达水平显著降低，Nrf2表达的抑制可能下调了下游HO-1和FTH1的表达，从而导致铁稳态失衡，细胞内亚铁离子浓度升高发生芬顿反应。

GPX4的抑制和芬顿反应都会产生大量ROS，HO-1的抑制导致无法有效清除ROS，进一步加剧了ROS的大量蓄积，流式细胞术也证实了ArBu处理SGC-7901细胞24 h后，脂质ROS水平显著升高，而ROS的蓄积最终诱发细胞铁死亡。

综上，ArBu能抑制Nrf2-HO-1/SLC7A11途径，破坏SGC-7901细胞的抗氧化应激系统，使细胞内铁代谢和GSH代谢失衡，亚铁的大量存在导致芬顿反应发生，GSH的耗竭使GPX4失活，HO-1的抑制使ROS无法有效清除，最终导致ROS蓄积，诱发铁死亡，抑制SGC-7901细胞增殖。本研究表明ArBu对SGC-7901细胞具有良好的抗肿瘤活性，为ArBu治疗GC提供了实验依据。

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