芍药苷预处理对大鼠心肌缺血-再灌注损伤氧化应激的保护作用及对Nrf-2/TXNIP/NLRP-3信号通路的影响

刘庆亮，杨自生，曹保江

急性心肌梗死，是指冠状动脉（冠脉）急性或持续性缺血缺氧造成的心肌细胞坏死[1]，是我国最常见的心血管疾病，具有高发病率、高病死率的特征[2]。临床治疗常采用支架植入术、冠脉介入术等治疗，可迅速改善心脏供血，但心肌细胞在缺血状态下恢复供血会再次造成心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI），预后将面临着巨大困难[3]。因此，减轻MIRI对心肌梗死临床治疗意义重大。芍药苷（paeoniflorin，PF）是提取自赤芍的主要有效单体化合物之一，为一种单萜类糖苷化合物[4]。赤芍是传统中草药毛莫科植物芍药和川赤芍的干燥根，属于清热凉血类中草药[5]。大量研究[6,7]表明，PF具有抗氧自由基损伤、抗肿瘤、调节免疫功能、抑制细胞内钙超载、降低血液黏度、抗炎、神经保护作用等药理作用。因此，本研究旨在通过建立MIRI大鼠模型，探讨PF对MIRI大鼠氧化应激损伤的影响及其可能作用机制，为PF药物开发及急性心肌梗死临床治疗提供参考依据。

1.1 实验动物选取80只8周龄SPF级雄性SD大鼠，动物购自北京斯贝福生物技术有限公司，合格证号：SCXK（京）2019-2010。体质量（210～230）g，相同饲养环境适应7 d，温度控制在（23±2）℃，环境相对湿度50%～60%，环境光暗周期各12 h，通风良好，适应期间饲喂普通饲料，自由饮水。

1.2 主要试剂和仪器PF（上海西格玛奥德里奇贸易有限公司，货号：PHL89384，规格：10 mg）；
盐酸地尔硫卓注射液（上海易恩化学技术有限公司，货号：R008495，规格5g/片）；
天冬氨酸氨基转移酶（AST）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）ELISA试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；
丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）试剂盒（南京建成生物工程研究所），兔抗鼠β-actin多克隆抗体、核因子E2相关因子2（Nrf2）、硫氧还蛋白互作蛋白（TXNIP）、NOD样受体蛋白3（NLRP-3）多克隆抗体、山羊抗兔二抗IgG（北京百奥莱博科技有限公司）；
全自动生化分析仪（上海帝博思生物科技有限公司，型号：PUZS-300）；
蛋白电泳仪、转膜仪（美国Bio-Rad公司）；
小动物呼吸机（南京卡尔文生物科技有限公司，型号：Hx-100E型）。

1.3 分组与给药80只SPF级雄性SD大鼠，随机选取65只大鼠采用结扎冠脉左前降支建立心肌缺血-再灌注（MIRI）模型，其余为对照组（15只），60只造模成功大鼠随机分为模型组、PF低剂量组、PF高剂量组、西药组，各15只。参考文献[8,9]用量，PF低、高剂量组灌胃给药60、120 mg/kg PF混悬液（生理盐水配制），西药组静脉注射给药1 mg/kg盐酸地尔硫卓注射液，对照组及模型组给予等量生理盐水，各组给药均为1/d，连续7 d。

1.4 MIRI大鼠模型建立适应性饲养7 d后建立MIRI模型，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠，仰卧位固定手术台上，连接ECGⅡ，手术部位常规消毒，颈部、胸部备皮，打开胸腔裸露心脏，使用丝线配合塑料管在左冠脉前支周围扎紧，活结打结30 min。剪去丝线，使冠脉恢复灌注120 min，ECGⅡ导联ST段抬高提示心肌缺血建立成功，再以ST段回落1/2视为MIRI模型建立成功[10]。

1.5 标本采集MIRI大鼠模型建立成功后，采集腹主动脉血液，将血液静置30 min，于4 ℃下3000 r/min高速离心机离心15 min，分离血清，-20℃保存。血液采集完毕，各组大鼠采用颈脱法处死，冰上剥离大鼠心脏组织，使用预冷的生理盐水反复冲洗，立即取一部分心脏组织剪至2～3 mm，投入4%多聚甲醛液固定24 h备用，其余组织装入无菌冻存管内，-80℃保存备用。

1.6 血清心肌酶水平检测取出分离好的血清和ELISA试剂盒，待ELISA试剂盒恢复至室温后开始检测。严格按照AST、CK、CK-MB、LDH试剂盒说明书操作，主要步骤为：将相同体积待测样品、标准液、蒸馏水加到对应测定管、标准管、对照管孔中，再加入250 μl缓冲液于各管中，加入50 μl辅酶A于测定管，置于37 ℃恒温水浴箱中加热20 min，加入二硝基苯于各管中，置于37 ℃恒温水浴箱中加热，添加2 ml的0.5 mmol/L氢氧化钠于各管中，室温静置5 min，测定各管吸光度（OD值），根据标准品梯度浓度结果建立标准曲线，代入待测样品OD值计算样品浓度。

1.7 氧化应激因子水平检测取出分离好的血清和ELISA试剂盒，待试剂盒恢复至室温开始检测，按照MDA、GSH-Px、SOD、CAT试剂盒说明书操作，主要步骤为：加入150 μl TBA稀释液、50 μl TBA储存液、3 μl抗氧化剂充分混匀配置检测工作液备用，再用蒸馏水将标准品稀释至2、5、10、20、50、100 μM，将标准品、待测样品、蒸馏水分别加入各板孔，加入检测工作液后，100℃水浴箱中15 min，室温下3000 r/min高速离心机离心10 min，取上清液加入96孔板中，酶标仪532 nm处测定吸光值，根据标准品浓度及其OD值导出标准曲线，结合待测样品OD值结果计算样品浓度并做好记录。

1.8 心肌组织HE染色观察取出4%甲醛固定24 h的心肌组织，使用蒸馏水反复洗涤固定液后，将心肌组织依次放入梯度浓度乙醇溶液30 min脱去水分，泡入二甲苯中透明。浸入石蜡中于50～60 ℃恒温箱中透蜡过夜，再放入冰箱4 ℃下待蜡块完全硬化。使用切片机切成4 μm薄片，使用梯度浓度乙醇再次脱蜡，浸入蒸馏水中5 min后，将切片放入苏木精染色液中染色30 min，清水冲洗15 min至切片变蓝。再将切片放入1%盐酸乙醇中褪色，切片变红即可，再次漂洗脱水。放入1%伊红乙醇溶液中复染3 min，再次脱水透明，最后使用中性树脂封片。阴凉处晾干后，将心肌组织切片置于光学显微镜下观察分析并拍照。

1.9 RT-PCR检测mRNA表达取出心肌组织，与500 μl Trizol裂解液室温下反应5 min，混匀后吸入1.5 ml EP管中，加入150 μl氯仿，混匀静置2 min，4 ℃下12 000 r/min高速离心机离心10 min，吸出上清液于新管中，加入无水乙醇，离心得到沉淀，获得总RNA。取8 μl RNA样品进行逆转录获得cDNA。配制RT-qPCR反应体系：GoTaqqPCRMaster 5 μl，CXR 0.1 μl，上、下游引物各0.5 μl，cDNA 1 μl，NucleaseFreeWater 2.9 μl。上机95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min进行40个循环。采集荧光信号，获得数据绘制曲线进行分析，目的基因的表达量以相对于内参的2-△△CT表示计算待测样品目的基因相对定量结果。反应引物序列设计为：

Nrf-2：上游（5"-CTTTAGTCAGCGACAGAA GGAC-3"），

下游（5"-AGGCATCTTGTTTGGGAATGTG-3"）；

TXNIP：上游（5"-GAGTACAAGTTCGGCTTC GAG-3"），

随着当代科学技术的蓬勃发展,多媒体技术越来越多地运用于高校的教学管理与实践工作中。传统教学模式与新技术、新设备的有机结合,一方面使教学内容与质量得到了全面的拓展与提高,另一方面也从技术人员的引进、技术设备维护等层面,给高校管理工作带来了新的挑战。因此,为了更好地提升高校教育环境,从而培养出符合时代精神的社会主义建设者和接班人,针对高校多媒体管理现状及其发展对策的研究,可谓势在必行。

下游（5"-ACCCAGTAGTCTACGCAACCA-3"）；

NLRP-3：上游（5"-TGTGAGAAGCAGGTTCT ACTCT-3"），

下游（5"-TGTAGCGACTGTTGAGGTCCA-3"）；

β-actin：上游（5"-GGCTGTATTCCCCTCCA TCG-3" ），

下游（5"-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3"）。

1.10 Western Blot检测蛋白表达取剩余心肌组织，加入适量RIPA裂解液提取蛋白，使用标准BCA蛋白测量试剂盒测定组织蛋白浓度。计算上样浓度，确定蛋白上样量，与配制好的SDSPAGE缓冲液一起于100℃预热3 min。将配制好的凝胶放入电泳槽，恒压80 V，电泳10 min，待蛋白电泳至浓缩胶处，电压120 V，30 min，电泳至溴酚蓝跑出分离胶底部即停止。电泳结束后，转移至PDVF膜上，使用TBST漂洗10 min×3次，然后浸入5%脱脂奶粉进行封闭，2 h后，将蛋白条带放入1:1000稀释一抗中，4 ℃孵育过夜，使用TBST漂洗10 min×3次，再加入1：5000稀释二抗进行孵育，1 h后，TBST漂洗10 min×3次，再滴加ECL工作液，获得成像，对目的条带光密度值进行分析。

1.11 统计学分析运用SPSS 23.0统计学软件进行数据分析，计量数据以（）表示，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行多组间比较，LSD-t检验进行两组间比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 各组大鼠心肌酶水平比较与对照组比较，模型组大鼠血清AST、CK、CK-MB、LDH水平升高（P＜0.05）。与模型组比较，PF低、高剂量组和西药组大鼠血清AST、CK、CK-MB、LDH水平降低（P＜0.05）。与PF低剂量组比较，PF高剂量组和西药组大鼠血清AST、CK、CK-MB、LDH水平降低（P＜0.05）。PF高剂量组大鼠血清AST、CK、CK-MB、LDH水平与西药组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），表1。

表1 各组大鼠心肌酶水平比较

2.2 各组大鼠氧化应激因子水平比较与对照组比较，模型组大鼠血清MDA水平升高，GSHPx、SOD、CAT水平降低（P＜0.05）。与模型组比较，PF低、高剂量组和西药组大鼠血清MDA水平降低，GSH-Px、SOD、CAT水平升高（P＜0.05）。与PF低剂量组比较，PF高剂量组和西药组大鼠血清MDA水平降低，GSH-Px、SOD、CAT水平升高（P＜0.05）。PF高剂量组大鼠MDA、GSH-Px、SOD、CAT水平与西药组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），表2。

表2 各组大鼠氧化应激因子水平比较

2.3 各组大鼠心肌组织HE染色比较结果显示，对照组大鼠心肌纤维排列整齐，边界清晰；
心肌细胞结构完整，无水肿现象，间质未见异常，染色均匀。模型组大鼠心肌纤维断裂且排列散乱无序，边界模糊不清；
心肌细胞结构残缺，间质存在水肿现象，且可见大量炎性细胞浸润，染色不匀。PF低、高剂量组和西药组大鼠心肌纤维断裂均得到改善，边界清晰；
心肌细胞水肿变性现象减少，结构完整，间质水肿现象减少，炎性细胞浸润现象显著减少，染色不匀现象得到改善（图1）。

图1 心肌组织HE染色结果（×200，标尺=50 μm）

2.4 Nrf2、TXNIP、NLRP-3 mRNA水平比较与对照组比较，模型组大鼠心肌组织中Nrf2 mRNA表达水平降低，TXNIP、NLRP-3 mRNA表达水平升高（P＜0.05）。与模型组比较，PF低、高剂量组和西药组大鼠心肌组织中Nrf2 mRNA表达水平升高，TXNIP、NLRP-3 mRNA表达水平降低（P＜0.05）。与PF低剂量组比较，PF高剂量组和西药组大鼠心肌组织中Nrf2 mRNA表达水平升高，TXNIP、NLRP-3 mRNA表达水平降低（P＜0.05）。PF高剂量组大鼠心肌组织中Nrf2、TXNIP、NLRP-3 mRNA表达水平与西药组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），表3。

表3 各组大鼠Nrf2、TXNIP、NLRP-3 mRNA水平比较

2.5 各组大鼠Nrf2、TXNIP、NLRP-3蛋白水平比较与对照组比较，模型组大鼠心肌组织中Nrf2蛋白表达水平降低，TXNIP、NLRP-3蛋白表达水平升高（P＜0.05）。与模型组比较，PF低、高剂量组和西药组大鼠心肌组织中Nrf2蛋白表达水平升高，TXNIP、NLRP-3蛋白表达水平降低（P＜0.05）。与PF低剂量组比较，PF高剂量组和西药组大鼠心肌组织中Nrf2蛋白表达水平升高，TXNIP、NLRP-3蛋白表达水平降低（P＜0.05）。PF高剂量组大鼠心肌组织中Nrf2、TXNIP、NLRP-3蛋白表达水平与西药组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），（表4，图2）。

图2 大鼠心肌组织蛋白检测

表4 各组大鼠Nrf2、TXNIP、NLRP-3蛋白水平比较

MIRI是指治疗急性心肌梗死时在短时间内血液灌注恢复后，心肌细胞损伤加剧，进一步造成心肌组织损伤的病理过程。MIRI因严重影响治疗预后，成为治疗急性心肌梗死的瓶颈问题。研究表明，MIRI包括细胞凋亡、钙离子通道阻塞、氧化应激和炎症损伤等多种发病机制，由多因素互相影响导致，且越来越多研究表明氧化应激是MIRI影响预后的中心环节[11,12]。赤芍是毛莫科植物芍药和川赤芍的干燥根，其中PF是其最主要有效活性成分之一[13]。近年来多项研究表明PF可缩小心肌梗死面积，改善心脏功能，抗氧化应激损伤，抑制细胞凋亡，但其作用机制尚不明确[14]。故本研究通过建立MIRI大鼠模型，从分子机制上探讨PF对大鼠心肌保护作用，并探究其可能作用机制。结果显示，模型组大鼠血清AST、CK、CK-MB、LDH水平升高，且大鼠体内氧化应激反应水平异常（MDA水平升高，GSH-Px、SOD和CAT水平降低）。提示模型组大鼠心肌组织受损严重，MIRI模型建立成功，且大鼠体内伴有氧化应激反应。在给予不同剂量PF和西药干预下均表现出血清AST、CK、CK-MB、LDH水平降低，且氧化应激因子水平下降，抗氧化酶GSH-Px、SOD和CAT水平也呈现逐渐回落的趋势。表明各组大鼠体内氧化应激反应得到抑制，因MIRI引起的心肌损伤也得到缓解。提示不同剂量PF和西药均可在一定程度上缓解MIRI大鼠体内的氧化损伤。此外，PF各剂量组大鼠心肌组织HE染色结果也表现出细胞水肿变性现象减少，进一步证实PF的心肌保护作用。为继续探索PF作用机制，应通过TXNIP/NLRP-3通路探讨PF对MIRI大鼠体内氧化应激水平的影响。

氧化应激反应是影响MIRI进展的重要机制之一，在MIRI发展过程中，TXNIP/NLRP-3信号通路一直发挥着重要作用，是参与细胞氧化应激、分化与凋亡等多项重要生理过程的信号调节通路[15]。在本研究中，模型组大鼠Nrf2 mRNA和蛋白表达水平明显降低，TXNIP、NLRP-3 mRNA和蛋白表达水平均大幅度升高，结合大鼠血清中抗氧化因子水平变化。提示模型组大鼠在手术刺激下，体内TXNIP/NLRP-3信号通路受到激活，抗氧化因子水平急速下降，氧化应激系统平衡失调。在正常生理状态下，TXNIP与Trx1结合，维持抗氧化能力，在MIRI形成过程中，氧自由基含量明显升高，Trx发生氧化反应与TXNIP解离，TXNIP受到过氧化因子刺激时会上调表达，促使与NLRP-3结合使炎性小体活化，加剧氧化应激因子释放，使得细胞结构遭到破坏，造成氧化损伤[16]。此时，提高机体内源性自由基清除剂GSH-Px、SOD、CAT水平，可减轻氧化应激反应，改善心肌损伤。研究报道，Nrf2激活后可抑制NLRP-3炎性小体活性，促使TXNIP与Trx1结合，从而提高机体的抗氧化能力[17]。在本研究中，PF各剂量组和西药组大鼠Nrf2 mRNA和蛋白表达水平较模型组大鼠明显升高，TXNIP、NLRP-3 mRNA和蛋白表达水平均降低，结合大鼠血清中抗氧化因子水平变化，可见激活Nrf2，抑制TXNIP/NLRP-3信号通路，对MIRI大鼠氧化损伤有积极的影响。

综上所述，PF能够调节MIRI大鼠血清中心肌酶的活性，提高抗氧化因子水平，改善氧化损伤，可能是通过调节Nrf-2/TXNIP/NLRP-3信号通路发挥抗氧化作用，为临床治疗急性心肌梗死提供实验依据。

猜你喜欢西药氧化应激试剂盒基于炎症-氧化应激角度探讨中药对新型冠状病毒肺炎的干预作用世界科学技术-中医药现代化(2020年2期)2020-07-25氧化应激与糖尿病视网膜病变西南军医(2016年6期)2016-01-23GlobalFiler~? PCR扩增试剂盒验证及其STR遗传多态性法医学杂志(2015年4期)2016-01-06GoldeneyeTM DNA身份鉴定系统25A试剂盒的法医学验证法医学杂志(2015年4期)2016-01-06氧化应激与结直肠癌的关系西南军医(2015年2期)2015-01-22消渴汤联合西药治疗糖尿病82例中国中医药现代远程教育(2014年11期)2014-08-08补肾养血通络方联合西药治疗糖尿病周围神经病变45例中医研究(2014年6期)2014-03-11参附芪养心汤联合西药治疗慢性心力衰竭50例中医研究(2014年2期)2014-03-11牛结核病PCR诊断试剂盒质量标准的研究当代畜禽养殖业(2014年6期)2014-02-27扩心宁煎剂联合西药治疗扩张型心肌病30例中医研究(2013年11期)2013-03-11