sgp130对糖尿病小鼠视网膜p-STAT3及VEGF-A表达的影响

刘光辉，史常旋，洪雅军，郑永征，王 航2，，孟 春2，

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最常见的微血管并发症和全球主要的致盲性眼病之一。DR发病机制复杂，至今仍未完全阐明。研究认为DR与蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)激活、多元醇代谢异常、己糖胺途径增加、蛋白非酶糖基化等多因素有关[1]。自1990年代以来，炎性因子在DR发病过程中的作用日益受到重视，越来越多的研究表明炎症反应异常激活在DR发病中起重要的作用[2-3]。白介素6(interleukin 6，IL-6)作为炎性因子在DR的启动及发展中具有重要的地位[4-5]。可溶性糖蛋白130(soluble glycoprotein 130，sgp130)是IL-6的游离受体，能够抑制IL-6反式信号转导通路介导的炎症[6]。本研究观察了糖尿病小鼠视网膜中IL-6、p-STAT3和VEGF-A表达及sgp130的拮抗效应，现报道如下。

1.1材料

1.1.1实验动物清洁级6周龄ICR雄性小鼠45只，购买自上海斯莱克实验动物有限责任公司[许可证号SCXK(沪)2017-0005]。实验动物的饲养及处理遵循国家科学技术委员会1988年颁布的《实验动物管理条例》执行。本实验通过福州大学实验动物伦理学委员会审查。

1.1.2主要试剂及仪器sgp130(福州大学生物科学与工程学院CHO-K1SP稳定细胞系表达并纯化)，抗IL-6抗体(1∶1000，美国abcam公司)，抗p-STAT3抗体(1∶1000，美国CST公司)，抗VEGF-A抗体(1∶1000，武汉爱博泰克生物科技有限公司)，抗β-actin抗体(1∶1000，美国Proteintech)，生物素标记的羊抗兔IgG(1∶5000，美国abcam公司)，链脲佐菌素(Streptozotoci，STZ；
美国Thermo Fisher公司)，RIPA裂解液、蛋白酶磷酸酶抑制剂(上海碧云天生物技术研究所)。G35注射器针头、纳升注射器(美国WPI公司)，蛋白垂直电泳槽(北京六一仪器厂)。

1.2方法

1.2.1动物模型及分组干预小鼠经简单数字随机法分为3组：正常组、DM组和sgp130组，每组各15只，其中DM组和sgp130组参考文献[7]的方法行DM造模。临用前以0.1mmol/L、pH4.5柠檬酸缓冲液溶解STZ，配制成1%溶液。小鼠禁食8h后，以STZ 60mg/kg进行腹腔注射，连续注射5d。造模结束3d后，取尾血行血糖测定，血糖≥11.1mmol/L者为造模成功。造模成功后，连续喂养10wk。于第1、5wk的第1d对sgp130组小鼠进行sgp130玻璃体腔注射，浓度为1.5mg/mL，注射量2μL，注射后予氧氟沙星滴眼液点眼，每日4次，共7d。正常组、DM组小鼠予常规喂养，不做特殊干预。

1.2.2蛋白免疫印迹法检测IL-6和p-STAT3及VEGF-A蛋白造模成功并喂养10wk后，采用2%戊巴比妥钠腹腔注射，过量麻醉处死所有小鼠，提取各组小鼠视网膜组织，每次随机选取各组组内3只小鼠眼球做为1个蛋白样本，每组各计3个样本。参考文献[7]的方法进行蛋白免疫印迹法检测。加入含有RIPA裂解液对视网膜组织进行匀浆，4℃条件下离心5min，取上清。以BSA为标准，用Bradford法对上清进行蛋白定量。取20μg蛋白样品，10% SDS-PAGE电泳，100V转移1h至硝酸纤维素薄膜，放入封闭液中37℃封闭1h，一抗4℃过夜。同时，另1张用不含抗体TBS-T液孵育，作为阴性对照。反复洗膜后，将膜与抗IgG抗体孵育，室温轻摇1h，洗膜后，用Western blotting印迹观察。以β-actin作为内参，采用Gel-Pro Analyzer 4分析条带光密度值，获取目的蛋白相对表达量。

统计学分析：采用Graphad 6进行数据处理，采用单因素方差分析进行多组间比较，进一步的两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2.1sgp130对IL-6和p-STAT3蛋白表达的影响各组间IL-6、p-STAT3表达差异具有统计学意义(F=37.085、137.370，均P<0.01)。DM组(1.234±0.154)和sgp130组(1.190±.212)IL-6的表达水平较正常组(0.271±0.055)均显著升高，差异具有统计学意义(t=2.674，P=0.01；
t=3.902，P=0.002)。DM模型鼠中，sgp130组和DM组IL-6的表达水平差异无统计学意义(t=0.379，P=0.784)，见图1A、D。DM组STAT3磷酸化增加，p-STAT3表达水平(0.989±0.030)较正常组(0.582±0.026)显著升高,差异具有统计学意义(t=0.22，P<0.01)。sgp130组p-STAT3表达水平(0.492±0.055)较正常组差异无统计学意义(t=2.736，P=0.061)，较DM组显著降低，差异具有统计学意义(t=1.861，P<0.01)，见图1B、D。

2.2sgp130对VEGF-A蛋白表达的影响各组间VEGF-A表达差异具有统计学意义(F=96.780，P<0.01)。DM组(0.509±0.047)和sgp130组(0.345±0.309)VEGF-A表达水平较正常组(0.140±0.008)均显著升高，差异具有统计学意义(t=3.447、3.754，均P<0.01)。DM模型鼠中，sgp130组VEGF-A表达水平较DM组低，差异具有统计学意义(t=0.362，P=0.007)，见图1C、D。

低度慢性炎症是DR发生发展中重要的因素，炎性因子在糖尿病视网膜微血管损害中具有重要的作用[2-3]。IL-6是人体中主要的炎性因子之一，主要由单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等分泌产生。在生理条件下，健康个体血液中IL-6的浓度几乎检测不到；
在炎症病理条件下，IL-6水平可显著上升[8]。临床研究表明，DR患者的血清、房水和玻璃体中IL-6水平均有升高，并参与了DR的进程[9-10]。基础研究结果提示，IL-6可诱导视网膜血管内皮细胞炎性损害，引发视网膜慢性炎症等连锁反应[7]。

IL-6的炎性效应主要由IL-6反式信号传导通路介导，即IL-6与游离IL-6受体R(soluble IL-6 receptor，sIL-6R)结合形成活化的IL-6/sIL-6R复合物，复合物再与gp130结合，引起gp130的二聚体化，从而启动细胞内信号传导[11]。在病理情况下，IL-6和sIL-6R表达量将急剧增长，形成大量的IL-6/sIL-6R聚合体，通过反式途径将IL-6信号传入胞内，再通过JAK/STAT信号通路诱导炎性信号传导因子STAT3磷酸化。并介导VEGF等下游炎症因子的过表达，诱发炎性损害[12]。

动物研究显示，糖尿病模型动物视网膜组织中IL-6及STAT3过表达，p-STAT3和VEGF明显增加[13-14]。临床观察表明，DR患者的血清和房水IL-6和sIL-6R浓度显著升高[15]；
DR患者房水中IL-6水平随着DR病变的严重程度增加，且与眼内VEGF的表达量呈正向相关性[16]。本研究结果显示，DM小鼠视网膜组织较正常组在第10wk即可出现IL-6表达增高，STAT3磷酸化水平也升高，提示存在炎症传导通路的激活，且下游炎症效应因子VEGF-A表达增强，与既往研究报道一致。因此，拮抗IL-6反式信号传导通路抑制炎症信号的传递可作为DR的一种潜在治疗手段。

sgp130是IL-6反式信号传导通路的天然拮抗剂。sgp130作为IL-6受体gp130的可溶性形式，广泛分布于全身。其能与IL-6/sIL-6R结合，使IL-6/sIL-6R失活[6]，在不影响经典信号转导的情况下选择性阻断IL-6反式信号转导，可起到负性调节的作用。已有研究证实，中和IL-6及IL-6R对风湿性关节炎、哮喘、炎性肠病等多种炎性疾病均有改善作用[17]。因此，增加外源性sgp130拮抗IL-6/sIL-6R可抑制IL-6引起的视网膜炎性损害。Valle等[18]体外研究结果表明sgp130-Fc可以抑制IL-6反式信号通路，减轻视网膜血管内皮细胞炎症和内皮屏障破坏。本研究从体内实验角度揭示了sgp130能够拮抗DM小鼠IL-6反式信号通路，下调STAT3磷酸化，降低p-STAT3的表达和下游炎症因子VEGF-A的表达。VEGF是DM导致视网膜损害的一个重要炎性因子，sgp130能够降低VEGF的表达，意味着sgp130能够拮抗DM引起的视网膜炎症损伤。然而，本研究也观察到sgp130并不能完全阻断VEGF表达水平的升高，提示VEGF的表达除了IL-6反式信号传导通路外，可能还存在着其他信号通路的调控。

IL-6也是一个多效因子，其对组织还具有保护和抗炎效应，这种效应主要是通过IL-6的经典信号传导通路来实现的。因此，完全阻断包含IL-6经典途径在内的信号传递可能带来不良的副反应，如增加细菌或病毒感染风险等[6]。理论上sgp130可以选择性拮抗IL-6反式信号通路，避免上述缺点。本研究的结果显示，sgp130对糖尿病小鼠视网膜中IL-6的表达并无显著影响，这可能与以下因素有关：(1)在DM状态下，视网膜中IL-6升高主要归因于IL-6系统性升高[7-8]；
(2)sgp130对单独的IL-6没有可测量的亲和力[6]，玻璃体腔注射sgp130失活的为IL-6/sIL-6R复合物，调控下游炎症因子的表达，作用范围局限于眼内，而对全身影响较小。研究还观察到sgp130并未完全阻断STAT3的磷酸化，这意味着外源性sgp130可以在不影响经典信号传导通路的情况下，实现选择性拮抗IL-6反式信号传导通路抑制炎症信号的传递，避免既往广谱阻断IL-6或IL-6R带来的副作用。这或将成为sgp130拮抗DR炎症损害的优势所在。

综上所述，sgp130可以选择性拮抗IL-6反式信号传导通路，降低DM小鼠视网膜STAT3的磷酸化，下调下游炎症因子VEGF-A的表达，可以用于干预DM引起的视网膜微血管的炎性损伤。

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