醋酸亮丙瑞林聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球的处方优化及评价

郭玉贤，刘磊，郑明秀，郭作娟，梁荣财，2*（.烟台大学药学院，烟台大学新型制剂与生物技术药物研究山东省高校协同创新中心，分子药理和药物评价教育部重点实验室（烟台大学），山东 烟台 264005；
2. 山东绿叶制药有限公司长效和靶向制剂国家重点实验室，山东 烟台 264003）

微球作为一类长效注射剂，通过将药物分散或包裹在生物可降解材料中，保护药物不被酶降解，实现缓释和控释给药，提高药物在体内的耐受性和患者的依从性，以获得良好的治疗效果[1-2]。生物可降解高分子材料因其疗效好、毒性低而被用于微球的制备[3]。其中聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）可以通过改变其组成、相对分子质量和化学结构来调节药物的释放，是目前应用最广泛的缓释微球骨架材料[4]。

醋酸亮丙瑞林是一种促黄体生成激素释放激素类似物，为水溶性九肽，具有高效的垂体-性腺系统抑制作用，可用于治疗激素敏感型前列腺癌、乳腺癌、子宫内膜异位症等疾病[5]。醋酸亮丙瑞林具有亲水性、易被酶降解、pH敏感的物理化学性质，因此存在生物利用度低、生物半衰期短等缺点，需频繁、长期给药[6-7]，将其开发成长效注射剂非常必要[8-9]。自美国食品药品监督管理局（FDA）于1989年批准以来，醋酸亮丙瑞林PLGA微球已成为现代长效释放基准产品，是国内外研究的热点[10]。

本研究采用W1/O/W2乳化溶剂挥发法制备醋酸亮丙瑞林PLGA微球，通过Box-Behnken响应面法优化处方，以制备粒径较小，包封率较高的微球，并对其粒径、载药量、包封率、表面形态、药物稳定性、体外加速释放行为等进行表征，为醋酸亮丙瑞林PLGA微球工业化大规模生产的处方设计提供参考。

IKA高速均质机（德国IKA公司）；
高速剪切分散乳化机（上海依卡机电制造有限公司）；
高效液相色谱仪LC25（Agilent公司）；
马尔文3000粒度仪（Malvern Instruments公司）；
EM-30型扫描电镜（韩国Coxem公司）；
GL21M高速冷冻离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司）；
电动搅拌器（德国IKA公司）；
pH计（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；
冷冻干燥机（宁波新芝冻干设备股份有限公司）；
SHZ-88水浴恒温振荡器（江苏金怡仪器科技有限公司）；
圆二色谱仪（Applied Photophysics Ltd公司）。

醋酸亮丙瑞林（中肽生化有限公司）；
二氯甲烷（南京化学试剂股份有限公司，分析纯）；
PLGA（7525 2A，山东绿叶制药有限公司）；
聚乙烯醇（PVA，德国Merck公司）；
吐温20（国药集团化学试剂有限公司）；
其余试剂均为色谱纯。

SD大鼠，雄性，体质量（200±20）g [济南朋悦实验动物繁育有限公司，实验动物许可证号：SCXK（鲁）20190003]。将大鼠圈养在（22±1）℃且12 h光照/黑暗循环的标准环境中饲养，并提供标准的饮食和水。所有动物实验均在烟台大学动物实验伦理委员会的指导原则下进行，符合欧盟指令2010/63/EU和国际实验动物评估和认可委员会的要求。

2.1 高效液相色谱条件

色谱柱：Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；
流动相：乙腈-三乙胺/磷酸盐缓冲溶液（15.2 g三乙胺溶于800 mL超纯水中，用磷酸调节pH 3.0，然后稀释至1000 mL）＝24∶76；
柱温：30℃；
流速：1 mL·min-1；
检测波长：220 nm；
进样量：20 μL[11]。醋酸亮丙瑞林的保留时间为8.79 min。

2.2 醋酸亮丙瑞林PLGA微球的制备

采用W1/O/W2乳化溶剂挥发法制备醋酸亮丙瑞林PLGA微球。将PLGA溶于二氯甲烷中形成油相（O），醋酸亮丙瑞林溶于水中，形成内水相（W1）。将油相加入内水相中，在冰水浴条件下21 600 r·min-1均质3 min 50 s，形成初乳（W1/O）。将初乳缓慢加入到1% PVA（W2），在高速剪切分散机的作用下，剪切2 min，形成复乳（W1/O/W2）。转移至恒温搅拌器中固化3 h，以除去大部分二氯甲烷。将所得溶液过180目筛网，离心水洗3次，冷冻干燥后收球。

2.3 Box-Behnken响应面法优化微球处方

通过前期单因素实验的考察，采取三因素三水平Box-Behnken响应面设计对微球粒径、包封率影响较为显著的三个因素进行处方优化。以理论载药量、PVA体积分数[φ（PVA）]、水油相比例（水油比）为自变量，以粒径（Y1）、包封率（Y2）为响应指标。每个自变量选择三个水平，如表1所示。

表1 Box-Behnken响应面设计因素及水平Tab 1 Factor and level of Box-Behnken response surface

按照Box-Behnken响应面法设计原理，17次实验设计方案及数据处理结果如表2所示，使用Design-Expert软件对各项实验数据拟合分析，得到的多项式模型如下：

表2 Box-Behnken响应面设计及其结果Tab 2 Design and response value of Box-Behnken response surface

①Y1：Y1＝44.18+11.56A-12.11B-5.78C-2.32AB-4.00AC+1.50BC-3.29A2-3.84B2-2.51C2（R2＝0.9922）。

②Y2：Y2＝93.79+4.50A+1.64B+4.71C+0.40AB-3.91AC-0.91BC-10.79A2-1.55B2+0.30C2（R2＝0.9911）。

对模型进行显著性检验及方差分析，结果如表3、4所示。Y1、Y2模型的F均较大（分别为98.88、86.97），P均小于0.0001，表明模型回归性显著；
模型失拟项的P均大于0.05，表明失拟项不显著，模型拟合度较高，可用于描述各因素与响应指标之间的关系。Y1、Y2模型的R2均大于0.9000（分别为0.9922、0.9911），表明模型相关性良好，可有效预测实验结果。

表3 粒径的响应面方差分析结果Tab 3 Variance analysis of particle size

根据拟合方程绘制三维响应曲图，进一步分析各因素与响应指标之间的相互作用，响应曲图越陡峭，表明该因素影响越显著。图1为粒径的响应面图，可以看出微球粒径随着φ（PVA）和水油比的增加呈现逐渐减小的趋势，随着理论载药量的增加呈现逐渐增大的趋势。结合表3可知，各因素对粒径响应值的影响依次为B＞A＞C。

图1 各因素对粒径影响的响应面图Fig 1 Response surface of the effect of various factors on the particle size

图2为包封率的响应面曲图。可以看出微球包封率随理论载药量的增加先增大后减小，随水油比的增加而增大，随φ（PVA）的增加而减小。结合表4可知，各因素对包封率响应值的影响依次为A＞C＞B。

表4 包封率的响应面方差分析结果Tab 4 Variance analysis of encapsulation efficiency

图2 各因素对包封率影响的响应面图Fig 2 Response surface of the effect of various factors on the encapsulation efficiency

2.4 最佳工艺的验证

得到软件模拟出的制备微球的最优处方为：理论载药量为7.59%，φ（PVA）为2%，水油比为200∶1。预测响应值：粒径为20.04 μm，包封率为97.16%。按最优处方制备的3批微球平均粒径为（20.81±1.34）μm，包封率为（95.88±1.56）%，预测值与实际值较为接近，说明该模型可有效预测实验结果。

2.5 微球的评价

2.5.1 粒径的测定 称取适量制备的微球，以超纯水为分散介质，超声1 min，使其分散均匀，测定其粒径。3批微球的粒径分别为20.89、20.54、21.01 μm，PDI分别为2.00、2.11、2.63，粒径分布图见图3。

图3 3批醋酸亮丙瑞林PLGA微球的粒径分布图Fig 3 Particle size distribution of 3 batches of leuprolide acetate PLGA microspheres

2.5.2 载药量和包封率的测定 精密称取10 mg微球，溶于少量乙腈中，超声使其溶解，用水稀释定容至10 mL，离心收集上清液，按“2.1”项下色谱条件测定醋酸亮丙瑞林的含量。分别以下式计算其载药量和包封率：

载药量（%）＝微球中醋酸亮丙瑞林的重量/微球总重量×100%

包封率（%）＝实际载药量/理论载药量×100%

按最优处方制得的3批微球的平均载药量为（7.28±0.27）%，包封率为（95.88±1.56）%。

2.5.3 表面形态 将适量微球粉末分散固定于导电胶上，真空状态下喷金后放置于扫描电镜中观察微球的表面形态，结果如图4所示。醋酸亮丙瑞林PLGA微球呈球形，表面圆整，且孔道较多。

图4 醋酸亮丙瑞林PLGA微球的表面形态Fig 4 Surface morphology of leuprolide acetate PLGA microspheres

2.5.4 药物的稳定性 精密称取适量醋酸亮丙瑞林原料药及PLGA微球，以乙腈-水为溶剂，配制成一定浓度的溶液，比较其高效液相色谱图和圆二色谱图。前者可以提供不同衍生物的定性信息，后者可以显示二级结构的变化[12]。由图5可知，提取出的药物与原料药的色谱图没有显著差别，表明微球制备过程不影响药物的化学完整性，不存在衍生化产物。圆二色谱图也没有明显的区别，199 nm和228 nm附近分别有一个负峰和一个正峰，其二级结构不受影响（见图6）。因此，醋酸亮丙瑞林的生物稳定性得到了较好的保留。

图5 原料药与醋酸亮丙瑞林PLGA微球的高效液相色谱图Fig 5 HPLC of API and leuprolide acetate PLGA microspheres

图6 原料药与醋酸亮丙瑞林PLGA微球的圆二色谱图Fig 6 CD spectra of API and leuprolide acetate PLGA microspheres

2.5.5 体外加速释放 精密称取20 mg微球置于25 mL离心管中，加入5 mL 5%（V/V）甲醇水溶液，在45℃、50 r·min-1条件下振荡释放。分别在2 h、8 h、24 h、2 d、3 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、11 d、13 d取样，离心，取出4 mL上清液，同时补加相同体积的释放介质。按“2.1”项下条件测定醋酸亮丙瑞林含量，计算其累计释放量，以时间为横坐标，累计释放度为纵坐标，绘制其累计释放曲线，结果见图7。醋酸亮丙瑞林PLGA微球在5%甲醇水中的释放呈双相特征。

图7 醋酸亮丙瑞林PLGA微球的体外累计释放曲线Fig 7 In vitro cumulative release profiles of leuprolide acetate PLGA microspheres

以零级释药模型、一级释药模型、Higuchi模型和Korsmeyer-Peppas模型分别对制备的醋酸亮丙瑞林PLGA微球体外累计释放曲线进行拟合，探究其释药机制，结果见表5。各拟合方程的相关性依次为：一级释药模型（R2＝0.9946）＞Korsmeyer-Peppas模型（R2＝0.9716）＞Higuchi模型（R2＝0.9706）＞零级释药模型（R2＝0.8418），因此药物在微球中的释放行为可用一级释药模型评价，表明微球呈浓度依赖性[13]。

表5 醋酸亮丙瑞林PLGA微球释药行为拟合方程Tab 5 Fitting equation of drug release behavior of leuprolide acetate PLGA microspheres

2.5.6 生物相容性 将8只SD大鼠随机分为4组，对背部进行脱毛处理，范围为2 cm×2 cm。A、B两组作为对照组，皮下注射生理盐水；
C、D两组作为实验组，皮下注射醋酸亮丙瑞林PLGA微球。在注射后的4 d和25 d分别处死大鼠，取出注射部位的组织，制备成石蜡切片，并用苏木精-伊红（HE）染色，观察大鼠的皮肤在注射部位上的差异。结果对照组和实验组注射部位外观无明显变化，皮肤组织无明显炎症反应，表明所制备的微球具有良好的生物相容性（见图8）。

图8 SD大鼠皮下注射生理盐水（A和B）、微球（C和D）后注射部位HE染色结果（×40）Fig 8 HE staining at the injection site after subcutaneous injection of normal saline（A and B）and microspheres（C and D）（×40）

微球因其巨大的工业价值和广阔的应用前景，已成为药剂学研究热点之一，但我国鲜有相关产品上市，醋酸亮丙瑞林微球作为国内首个上市的微球产品，其工业化规模尚有待扩大[14-15]。本研究采用Box-Behnken响应面法对醋酸亮丙瑞林PLGA微球处方进行优化，通过多元二次回归方程来拟合相关因素与响应值之间的函数关系，得到最优处方的实测值与预测值较为接近，说明响应面法优化微球处方合理可行，准确度高，重现性良好。

本研究选用粒径和包封率作为响应值能直观反映微球制备工艺。三个因素中，φ（PVA）和理论载药量对粒径的影响更大，这是由于φ（PVA）的增加使得外水相黏度增加，液滴聚结减少，形成更小的液滴；
另一方面理论载药量增加，引起内水相黏度增加，乳滴变大，微球粒径随之增大[16]。理论载药量和水油比对包封率的影响更大，这是由于理论载药量增加，药物被包封的概率也随之增加，但同时初乳浓度梯度逐渐增大，促使药物流失到外水相中；
另一方面，随着外水相体积的增加，有机溶剂接触到的水体积增加，从而使聚合物聚结速度更快，限制了药物的外溢，使更多药物保留在微球中[9]。

体外释放行为是评价微球性质的关键性参数。注射用双羟萘酸曲普瑞林使用的释放介质为5%甲醇水溶液。由于亮丙瑞林和曲普瑞林同为促性腺激素释放激素类似物，其释放行为可能具有相似性[17]。因此，本研究选择5%甲醇水作为释放介质。醋酸亮丙瑞林PLGA微球的释放可分为两个阶段，前期快速释放阶段可能是因为微球表面药物的快速溶解，此时微球的释放机制为扩散作用[18]；
后期药物的释放可能是由于PLGA的降解，微球骨架结构被逐渐破坏，药物通过孔道和骨架的溶蚀逐渐从微球内部扩散到介质中[19]。

本研究所制备出的醋酸亮丙瑞林PLGA微球包封率高，药物稳定性和生物相容性良好，可为其工业化生产的处方设计提供参考，但其生物有效性有待进一步研究。

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