牦牛ANXA5基因的克隆、序列分析及表达研究

范依琳,赵 丹,马 妍,岳永起,冯欣欣,张姬越,字向东,熊显荣,付 伟,熊 燕

(1.西南民族大学 畜牧兽医学院,四川 成都 610041;2.西南民族大学,青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室,四川 成都 610041;3.西南民族大学,青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室,四川 成都 610041)

牦牛(Bosgrunniens)作为世界最著名牛种之一,能够生活在低温、缺氧、恶劣的高海拔地区,被誉为“高原之舟”[1]。牦牛不仅是我国高寒牧区重要的反刍畜种[2-3],还为青藏高原及邻近地区的牧民提供肉奶等必需品[4],拥有无法取代的生态经济学地位。但牦牛的繁殖效率低、具有明显季节性,极大地限制其饲养和生产效率,因此,提高牦牛繁殖性能成为畜牧工作者的工作重点。

膜联蛋白(Annexin,ANX)是Ca2+依赖的磷脂结合膜联蛋白家族,已发现12个成员存在于脊椎动物;ANX能够可逆的锚定到细胞膜上[5],具有多种生物学功能,包括参与细胞膜组成、调节离子通道、细胞信号转导等[6]。膜联蛋白A5基因(ANXA5)位于染色体4q26-q28上,包含内含子12个,外显子13个[5]。ANXA5最早在人类胎盘中被发现,称为胎盘抗凝血蛋白[7],研究表明其为可溶性蛋白,以Ca2+依赖性方式结合到包含带负电荷的磷脂(主要是磷脂酰丝氨酸)的生物膜上[8];同时ANXA5是膜联蛋白家族中最小的成员,因为它可以在膜表面上自主组装成有序的二维(2D)阵列,被称之为具有独特膜结合性质的蛋白质[9]。此外,ANXA5也被广泛认为是磷脂酶A2和蛋白激酶C的内源性抑制剂[10],目前,对于ANXA5基因的研究大多集中于癌细胞的调控方面。

已有研究证明,ANXA5对雄性生殖器官发挥正常功能具有调控作用。如ANXA5是miR-506-3p的靶基因,抑制ANXA5表达可在体内外一定程度上加重大鼠睾丸氧化应激的损伤[11]。其他研究表明,ANXA5通过ERK/Nrf2途径保护睾丸间质细胞(Leydig cell)和支持细胞(Sertoli cell)免受氧化应激的损伤[12]。ANXA5的表达水平影响复发性流产(RPL)的发病机制,抑制ANXA5的表达可增加RPL的风险;ANXA5启动子的单倍型还可以用作预测RPL预后的潜在生物标志物[13]。此外,有研究发现,ANXA5在卵巢中呈细胞型特异性表达[14]。另有学者发现,ANXA5在黄体细胞中有表达,但不在颗粒细胞中表达,提示ANXA5可能与颗粒细胞黄体化过程密切相关[15]。由此可见,ANXA5对动物生殖器官维持正常生理功能具有重要作用,但目前未见有关牦牛ANXA5基因的报道,关于ANXA5是否参与牦牛繁殖过程的调控尚不清楚。本研究旨在通过克隆牦牛ANXA5基因,分析其生物学特性,测定其在牦牛组织和颗粒细胞中表达模式,为深入研究ANXA5对牦牛繁殖调控作用奠定基础。

1.1 样本采集

采集5头体况正常、年龄4～5岁的金川母牦牛,采样地点为成都青白江唐家寺屠宰场。屠宰后,使用无菌剪刀剪取组织,包括心、肝、脾、肺、肾、子宫、卵巢、输卵管等,用生理盐水冲洗,迅速放入液氮保存。其中,2头牦牛一侧卵巢置于PBS中,另一侧卵巢置于4%的多聚甲醛,进行颗粒细胞培养以及切片的免疫组化分析。

1.2 主要试剂

TRIzol购于美国Invitrogen公司;反转录试剂盒、pMD-19载体购于美国Thermo Scientific公司;胶回收试剂盒、DH5α感受态细胞、购于成都擎科梓熙生物技术公司;DEME/Ham′s F12购于美国Gibco公司;2×Plus SYBR real-time PCR pre mixture 购自北京百泰克生物技术公司;一抗Rabbit Anti-ANXA5 antibody购于沈阳万类生物科技有限公司。

1.3 牦牛ANXA5基因克隆

根据GenBank上黄牛的ANXA5基因(NM_001040477牛),预测牦牛的ANXA5基因克隆序列,Primer Premier 5.0软件设计PCR引物(表1),合成引物工作交由成都擎科梓熙生物技术有限公司完成。模板为通过TRIzol法提取的总RNA,参照反转录试剂盒反转录成cDNA,以此为模板进行PCR反应,反应体系为20 μL(Taq酶 12.5 μL,上下游引物各1 μL,cDNA 1 μL,ddH2O 9.5 μL),反应程序为:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,57 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,设置32个循环;72 ℃延伸15 min,4 ℃保存。使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测产物,并根据胶回收试剂盒说明书对目的条带进行胶回收。将纯化后的产物与pMD-19载体连接并置于16 ℃过夜,后将连接产物加入DH5α感受态细胞,转化后加入LB液体培养基振荡摇匀后培养45 min,将复苏后的菌液涂布于含0.1 mg/mL氨苄的LB固体培养基表面,37 ℃培养12～16 h,挑出3个单克隆分别加入有含氨苄的液体LB液体培养基中摇床4～6 h后进行菌液PCR,将阳性克隆送至成都擎科梓熙生物技术有限公司进行双向测序,得到ANXA5基因序列。

表1 引物信息Tab.1 Primers information

1.4 牦牛ANXA5基因生物学特性分析

通过DNAMAN软件拼接,获得牦牛ANXA5基因序列,而后分析牦牛ANXA5基因生物学特性:开放阅读框预测(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/);序列比对(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/);蛋白质理化性质的分析(https://web.expasy.org/protparam/、http://www.cbs.dtu.dk/services/Signal P/、https://web.expasy.org/protscale/、http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/、https://psort.hgc.jp/form2.html/、http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/、http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc-4.0/);蛋白质结构及互作预测(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html/、https://swissmodel.expasy.org/interactive/、https://string-db.org/)。利用DNAMAN软件、MEGA 7.0软件分别比对物种间氨基酸与核苷酸序列,并采用邻接法(Neighbor-joining,NJ)构建物种进化树,构建方法如下:NCBI上Blast后的数据导入MEGA 7.0软件、进行多序列比对、利用多序列比对结果建树、完善树枝名称信息、导出系统进化树结果图。

1.5 颗粒细胞培养

首先用75%乙醇快速清洗牦牛卵巢2次,再用PBS清洗3次。使用带有10 mL针头的注射器从2～8 mm的卵泡中依次吸取卵泡液后加到15 mL离心管中[15],用移液枪多次吹打,使颗粒细胞充分分散。而后在2 000 r/min的条件下离心,弃上清,让细胞再次悬浮于含1%青霉素/链霉素以及10%胎牛血清的DEME/Ham′s F12中[16]。在24孔板中每孔加入约1×105个细胞,37 ℃,5% CO2下培养72 h后直接传代,用于后续试验。

1.6 RT-qPCR

特异引物根据牦牛ANXA5基因序列设计(表1),采用实时荧光定量PCR技术(Quantitative real-time PCR,RT-qPCR)检测ANXA5基因在牦牛不同组织中的表达以及在培养24,36,48,72 h牦牛卵巢颗粒细胞中的表达,并将GAPDH用作内参基因以校正表达水平。反应体系为15 μL(PowerUpTMSYBRTMGreen MasterMix 7.5 μL,上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L),cDNA 1 μL,ddH2O 5.5 μL),反应程序同PCR反应。

1.7 免疫组化

从4%多聚甲醛中取出固定24 h的牦牛卵巢组织,制成石蜡切片。切片在0.01 mol/L柠檬酸缓冲液中煮沸15 min以进行抗原修复,然后将切片置于PBS(pH值7.4)脱色摇床上,洗涤3次,每次5 min。阻断内源性过氧化物酶,滴加3% BSA,室温下封闭30 min。将一抗滴于切片上,将切片平放于潮湿的盒子中,4 ℃孵育过夜。弃去一抗,然后加入二抗室温孵育1 h。加入新制备的DAB显色溶液,在显微镜下控制显色时间,阳性为棕黄色,然后用无菌水冲洗。苏木精反染后,将载玻片脱水固定。使用蔡司共聚焦显微镜采集图片。

1.8 数据分析

采用2-ΔΔCt法[17]分析荧光定量结果。通过GraphPad Prism软件的One-way ANOVA法分析基因表达的差异显著性,数据表示为“平均数±标准误”。P<0.05时差异有统计学意义。

2.1 牦牛ANXA5基因克隆

利用琼脂糖凝胶电泳,检测PCR扩增产物,获得一条清晰条带,条带长度符合预测序列的扩增长度(图1-A)。通过Sanger测序得到PCR产物长度为1 168 bp,CDS区966 bp,编码321个氨基酸。与黄牛的核苷酸序列相似度为99.38%,碱基序列存在6个突变位点(图1-B)。

A.牦牛ANXA5基因扩增结果:M.DL2000 DNA Marker,1—4.ANXA5目的条带;B.牦牛和黄牛ANXA5基因序列差异。A.Amplification of yak ANXA5 gene:M.DL2000 DNA Marker,1—4.ANXA5 target band;B.Sequence difference of ANXA5 gene between yak and cattle.图1 牦牛ANXA5基因克隆Fig.1 Cloning of yak ANXA5 gene

2.2 物种间ANXA5基因同源性比较与系统进化树分析

克隆得到的牦牛ANXA5基因,分别与黄牛(Bostaurus,NP 001035567.3)、瘤牛(Bosindicus,XP 019817755.1)、山羊(Caprahircus,XP 017904654.1)、绵羊(Ovisaries,XP 012034784.2)、猫(Feliscatus,XP 006930945.1)、人(Homosapiens,NP 001145.1)、大鼠(Rattusnorvegicus,NP 037264.2)、小鼠(Musmusculus,NP 033803.1)、原鸡(Gallusgallus,NP 001026709.1)的ANXA5基因进行同源性对比(表2),发现与黄牛的核苷酸和氨基酸相似性最高,牦牛和其他哺乳动物ANXA5基因相似性均高于90%,可见ANXA5基因在物种间保守。用核苷酸序列构建进化树(图2)的结果显示,牦牛和黄牛、瘤牛聚为一类;与原鸡的亲缘关系最远,符合物种进化规律。

表2 牦牛与10个物种ANXA5基因相似性比对Tab.2 Gene similarity between yak ANXA5 gene and other 10 species %

图2 基于ANXA5基因核苷酸构建的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree based on nucleotide sequence of yak ANXA5 gene

2.3 牦牛ANXA5蛋白质理化性质

用软件分析ANXA5蛋白质理化性质,分子式C1593H2551N429O502S8,理论等电点4.97,分子质量36.001 ku,半衰期30 h,脂肪系数92.40,不稳定系数36.34,总平均亲水性-0.324。此外ANXA5由321个氨基酸组成,其中含量超过8%的氨基酸有4种,分别是亮氨酸(Leu)、谷氨酸(Glu)、丙氨酸(Ala)和天冬氨酸(Asp);带负电荷(Asp+Glu)的氨基酸残基总数更高,为54,提示牦牛ANXA5可能带负电荷。牦牛ANXA5蛋白无信号肽(图3-A)和跨膜结构(图3-B)。亚细胞定位预测显示,牦牛ANXA5基因主要存在于细胞质(Cytoplasmic)。

A.牦牛ANXA5基因信号肽分析;B.牦牛ANXA5基因跨膜结构分析。A.Signal peptide analysis of yak ANXA5 gene;B.Transmembrane analysis of yak ANXA5 gene.图3 牦牛ANXA5基因预测Fig.3 Prediction of yak ANXA5 gene

二级结构预测显示,ANXA5蛋白包含α-螺旋为73.83%,无规则卷曲为22.12%,β-转角为2.49%,延伸链结构为1.56%(图4-A)。预测ANXA5的蛋白三级结构模型与二级结构相符(图4-B)。蛋白相互作用分析显示,有多种蛋白可能与ANXA5蛋白发生相互作用,如CASP8、CASP3、AKT1等(图4-C)。

A.牦牛ANXA5蛋白二级结构预测:e.延伸链,h.α-螺旋,c.自由卷曲,t.β-转角;B.牦牛ANXA5蛋白三级结构图;C.牦牛ANXA5蛋白质互作网络。A.Secondary structure prediction of yak ANXA5 protein:e.Extended strand,h.α-helix,c.Random coil,t.β-turn;B.Tertiary structure of yak ANXA5 protein;C.Protein interaction network of yak ANXA5 protein.图4 牦牛ANXA5蛋白预测Fig.4 Prediction of yak ANXA5 protein

2.4 牦牛ANXA5基因的组织表达谱及ANXA5卵巢定位

采用qPCR法检测ANXA5基因在8种不同牦牛组织中的表达情况(图5-A)。结果表明,肺的表达量最高,其次是子宫,二者与其他组织间差异极显著(P<0.01);在输卵管中表达量较高,与卵巢组织相比差异显著(P<0.05),与其他组织间表达量同样具有极显著差异(P<0.01);在卵巢组织中也有中度的表达,其与脾中表达量呈现显著差异(P<0.05),与其余组织间有极显著表达差异(P<0.01)。运用免疫组织化学染色法检测ANXA5在牦牛卵巢中的表达模式(图5-B)。结果显示,ANXA5在牦牛卵巢中表达,但黄体细胞阳性染色程度较高,闭锁卵泡内亦出现阳性反应(图5-C)。

A.ANXA5在牦牛不同组织中的相对表达量(以肾表达水平作为对照,GAPDH作为内参基因);B.ANXA5在牦牛卵巢中的定位:a.阴性对照-次级卵泡,b.阴性对照-黄体,c.阴性对照-闭锁卵泡,d.ANXA5阳性染色-次级卵泡,e.ANXA5阳性染色-黄体,f.ANXA5阳性染色-闭锁卵泡;C.ANXA5在颗粒细胞及黄体中的平均染色强度。不同小写字母表示差异显著(P<0.05);不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。图6同。A.The relative expression level of yak ANXA5 gene in different organizations(The kidney expression level was used as the control,GAPDH as the internal reference gene);B.Localization of ANXA5 in yak ovary:a.Negative control-Secondary follicle,b.Negative control-Corpus luteum,c.Negative control-Atresia follicle,d.ANXA5 positive staining-Secondary follicle,e.ANXA5 positive staining-Corpus luteum,f.ANXA5 positive staining-Atresia follicle;C.Average staining intensity of yak ANXA5 in granular cells and corpus luteum.Different small letter superscripts indicate significant difference(P<0.05);different capital letter superscripts indicate extremely significant difference(P<0.01).The same as Fig.6.图5 牦牛ANXA5基因组织表达与ANXA5蛋白定位Fig.5 Tissue expression of ANXA5 gene and mapping of ANXA5 protein in yak

2.5 牦牛ANXA5基因的体外培养颗粒细胞时序表达模式

选择GAPDH基因为参照,运用qPCR法检测在不同时期卵巢颗粒细胞中牦牛ANXA5基因的表达情况(图6)。结果表明,培养72 h的颗粒细胞中ANXA5表达量最高,与培养24 h颗粒细胞间差异极显著(P<0.01),与36 h颗粒细胞间差异极显著(P<0.01);其次是在培养48 h的颗粒细胞中表达量较高,与培养24 h颗粒细胞间差异极显著(P<0.01),与培养36 h颗粒细胞间差异显著(P<0.05),但培养72 h颗粒细胞与培养48 h颗粒细胞间、培养36 h颗粒细胞与培养24 h颗粒细胞间表达量无显著差异(P>0.05)。

图6 ANXA5在牦牛不同时期卵巢颗粒细胞中的相对表达量Fig.6 The relative expression of yak ANXA5 gene in ovarian granular cells at different stages

本研究经过克隆得到了牦牛ANXA5基因的产物长度为1 168 bp,CDS区966 bp,在碱基序列中编码321个氨基酸。其中,占比最高的是Leu。有研究表明,存在于胎盘上的氨基酸转运系统调控着Leu转运系统,而Leu转运系统是氨基酸从母体进入胚胎血循环的关键[18]。此外,ANXA5是一种在胎盘中大量表达的蛋白质,有助于妊娠时胎儿的正常发育[19],表明ANXA5对于调控牦牛的胚胎发育具有重要的作用。牦牛与10个物种对比ANXA5基因相似性,黄牛与其核苷酸、氨基酸相似性皆为最高,与进化树分析的结果一致。氨基酸比对分析中还显示,牦牛ANXA5基因与其他哺乳动物相比,相似性超过90%,这符合物种进化演变规律。

蛋白相互作用分析显示,与ANXA5可能存在相互作用关系的蛋白有10个,包括CASP8、CASP3、AKT1等。其中,CASP8在前列腺癌组织中蛋白表达更高;而与非复发性前列腺癌患者相比,复发性前列腺癌患者的CASP8 mRNA水平也更高,这提示CASP8可能是潜在高危前列腺癌和肾癌的生物标志物[20]。其他互作蛋白如AKT1,研究发现其过表达和活化状态在子宫内膜癌等多种恶性肿瘤的发生发展起着重要作用[21]。由此可见,与ANXA5存在相互作用的蛋白主要与生殖相关器官的病变有关。

ANXA5在各组织中广泛分布,本研究通过荧光定量PCR试验得知,ANXA5在牦牛肺组织中表达最高,说明ANXA5可能对肺组织有较强的直接作用,这是否与牦牛对高海拔低氧环境的适应性相关有待进一步研究;在子宫、输卵管和卵巢组织中表达水平较高,可能与这些组织抗氧化损伤,维持正常生殖功能有关。此前有报道称ANXAS在宫颈癌和子宫内膜癌内的表达相较正常组织中有所减少[22],这表明ANXA5的表达量确实参与生殖器官病变的发生,但究竟ANXA5是导致癌变的原因还是癌症带来的结果,目前尚未可知。

ANXA5在牦牛卵巢中有广泛表达。免疫组化结果显示,ANXA5在牦牛卵巢髓质及皮质均表达,其主要在细胞质表达,这与孙旭娟[23]采用免疫荧光法观察ANXA5定位的结果一致。在黄体中ANXA5表达更为显著,呈现阳性染色,而在次级卵泡中的颗粒细胞胞质中未见阳性反应,这与在小鼠上的研究结果大致相符[15],说明ANXA5在卵巢中的表达不具有物种特异性。此外,观察到闭锁卵泡中同样有ANXA5表达。以前有报道称部分哺乳动物会出现闭锁黄体[24],推测可能是卵泡闭锁过程中发生了黄体化,ANXA5在进入塌陷卵泡腔内的滤泡细胞中表达。

ANXA5在牦牛不同时期卵巢颗粒细胞中均有表达,荧光定量PCR结果表明ANXA5的表达随着颗粒细胞培养时间的延长呈现上升的趋势。此前,有研究表明血清培养48 h后颗粒细胞开始发生黄体化[25],表明ANXA5与牦牛卵巢组织黄体化过程密切相关。然而,上述结果与Kawaminami团队[14]研究得到ANXA5在黄体细胞中表达,而不在颗粒细胞中表达的结果不完全一致。此外,有报道称ANXA5参与真核细胞质膜修复机制,ANXA5与被破坏的膜区域结合,促进破裂质膜快速重新密封[26]。因此,推测ANXA5在早期体外培养的卵巢颗粒细胞中表达可能发挥维持卵巢颗粒细胞质膜完整性,保护卵巢颗粒细胞在体外环境中正常生长等作用。

本试验成功克隆了产物长度为1 168 bp,CDS区为966 bp,共编码321个氨基酸的牦牛ANXA5基因。ANXA5基因表达于牦牛多种组织,肺组织是ANXA5表达水平最高的部位,子宫、输卵管和卵巢次之,可能ANXA5对牦牛这些组织生理功能的维持具有重要调节作用。同时,ANXA5基因在不同时期牦牛卵巢颗粒细胞中均有表达,尤其在培养48 h后的颗粒细胞中显著表达,这可能与体外培养48 h后的颗粒细胞开始黄体化有关,免疫组化结果显示,ANXA5主要在牦牛卵巢中的黄体细胞表达,为进一步研究ANXA5调控牦牛的繁殖调控机制奠定基础数据。

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