分子模拟预测离子液体修饰南极假丝酵母脂肪酶B修饰位点

张晓光,鲁泽平,徐 超,胡 燚

(南京工业大学 药学院,材料化学工程国家重点实验室,江苏 南京 211800)

脂肪酶(EC 3.1.1.3)是一种丝氨酸水解酶,能够催化三酰基甘油水解成甘油和脂肪酸。基于脂肪酶在水解、酸解、醇解和酯交换过程中对各种底物的独特催化活性,其被广泛应用于油脂化工、食品加工、制浆造纸、污水处理、制药工程等领域[1-2]。然而,由于酶的空间结构极易受到高温、高盐度、极端pH等多种因素的影响,这阻碍了其在诸多领域的实际应用[3]。近年来,化学修饰被证实为一种有效的脂肪酶分子改造方法,通过化学修饰剂对蛋白质表面特定的氨基酸进行修饰,可以在一定程度上提高生物催化剂的性能[4-6]。

离子液体(ionic liquid,ILs)由于其独特的性质和可设计性,在酶催化领域中得到了广泛的应用[8-9]。在课题组之前的研究中,将咪唑、胆碱等不同类型的功能化离子液体对南极假丝酵母脂肪酶B(lipase B fromCandidaantarctica, CALB)、猪胰脂肪酶(lipase from porcine pancreatic, PPL)、褶皱假丝酵母脂肪酶(lipase fromCandidarugosa, CRL)等脂肪酶进行了共价修饰[10-12]。结果发现,离子液体作为修饰剂可以同时提高脂肪酶包括水解活性、稳定性和选择性等各种催化性能。近年来,分子模拟技术飞速发展,利用分子模拟对酶的性质变化、反应机制进行合理分析,并进一步指导酶在分子水平上的修饰成为当前热点。如从光滑念珠菌获得的酮还原酶CgKR1表现出广泛的底物特异性,但对大多数底物的催化活性很低。为了获得高性能酮还原酶CgKR1突变体,Zheng等[13]利用分子动力学(MD)模拟、分子力学和分子对接法,识别出两个关键残基(Phe92和Phe94),解析出底物与酶突变体之间较高的结合亲和力是提高催化酶活性的部分原因。Gong等[14]利用分子模拟技术,研究了酮还原酶LbCR的两种突变体A201D/A202L的结构-功能关系,对不同结构的分析表明,突变酶热稳定性的提高在很大程度上归因于活性位点周围形成额外的氢键和疏水相互作用。

本课题组在近期设计了4种新型手性脯氨酸离子液体修饰CALB,并利用肽质量图纹图谱确定了修饰的位点,将分子模拟技术与现代光谱学表征相结合,深入解析了离子液体修饰脂肪酶后酶学性能变化的机制[15]。然而,酶的化学修饰过程随机性大,酶表面氨基酸残基的分布,修饰剂种类的不同都会影响修饰位点和修饰度。不同脂肪酶的分子改造对离子液体修饰剂的分子结构和修饰条件有不同的要求,修饰剂分子结构设计具有较大的盲目性,修饰位点通常又需要繁琐的肽谱解析过程才能确定,这对进一步筛选高效的修饰剂造成了阻碍。在前期工作基础上,本文拟运用分子模拟技术建立一种简单而新颖的预测修饰部位的方法,通过分析赖氨酸残基的溶剂可及性面积(solvent accessible surface area,SASA)以及与周围氨基酸的成键情况,筛选出最有可能被修饰的赖氨酸位点。本研究可以为以后理性指导脂肪酶催化性能强化改造及筛选具有卓越性能的离子液体修饰剂提供更加简便、高效的方法。

所有的模拟都是在DELL-3620工作站上使用Gromacs 2018.1[16]软件完成。CALB的初始结构从蛋白数据库中获取(1TCA),分辨率为0.155 nm[17]。动力学模拟前,需要去除晶体结构中的配体(N-乙酰-D-氨基葡萄糖NAG)分子,保留晶体结构中的结晶水,两性残基设置为 pH=7.0时的电离状态。

4种脯氨酸离子液体的结构如图1所示,首先设置好带电荷的原子,使用Chemoffice 3D软件自带的分子力学2(molecular mechanics 2,MM2)力场对初始结构进行结构优化,使用Malde等[18]自动拓扑结构生成器(automated topology builder,ATB)在线软件生成Gromacs可以识别的4种脯氨酸离子液体的电荷及力场参数。之后,使用Gromacs自带的建模命令构建蛋白处在离子液体中溶剂体系。为尽量与实际实验条件吻合,所有模型模拟在277 K、1.01325 MPa、pH 7.0条件下进行,用Martínez等[19]开发的Packmol软件实现体系中离子液体的随机分布。残基的质子化状态由Li等[20]开发的PROPKA在线服务器预测。采用Gromacs 54a7力场、显示模型简单点电荷模型(simple point charge,SPC)、Darden等[21]开发的PME(particle mesh ewald)处理长程静电作用,远程静电截断值为1.2 nm、远程范德华力(range van der Waals, rvdw)的截断值为1.2 nm、压力模拟体系采用Parrinello等[22]开发的Parrinello-Rahman算法(耦合常数为0.1 ps),温度模拟采用Bussi等[23]开发的V-rescale算法(耦合常数为0.5 ps),用Jean-Paul等[24]开发的LINCS算法固定所有的共价键,相对偏差设为10-4。

图1 脯氨酸离子液体修饰剂结构[15]

模拟的具体步骤如下:体系采用周期性立方体cubic盒子,并将CALB置于中心,周围填充100对离子液体阴阳离子对,其余部分采用spc216水模型填充,并在模型中加入7个Cl-来中和电荷,使体系整体的电荷为零。所有模拟体系采用最陡下降法优化5 000步的能量,之后进行500 ps的限制性动力学模拟确证体系已达到平衡。最后,进行20 ns非限制性动力学模拟,步长为2 fs,每隔1 ps收集一次全部原子坐标,模拟结束后使用Gromacs自带的分析命令分析蛋白整体构象以及赖氨酸残基的溶剂可及性面积变化,使用Humphrey等[25]开发的视觉分子动力学(visual molecular dynamics,VMD)可视化软件进行分析蛋白内氢键和盐桥作用,氢键的判定采用几何判定准则,角度截断值设为120°,半径截断值设为0.35 nm。蛋白质结构图采用Giacomo等[26]开发的PyMOL程序进行绘制,CALB在水相以及4种离子液体溶剂体系的模型图如图2所示。

图2 溶剂中CALB的分子动力学模拟

2.1 蛋白质能量及结构变化

图3为CALB在5种溶剂体系中总能量的变化,在20 ns内,蛋白质一直保持着较低的能量。图4为在20 ns内、在不同溶剂体系中,CALB蛋白的均方根偏差(RMSD)的变化。在水相中的模拟5 ns内RMSD浮动较大,之后维持在0.13 nm左右波动。而在离子液体中的CALB的RMSD在前2.5 ns波动较大,之后蛋白的结构迅速趋于稳定。与在水相中相比,离子液体溶剂体系中的酶可以更快地进入稳定状态,这也与很多研究一致,离子液体作为溶剂时,可以提高酶的稳定性[27]。通过模拟发现,经过20 ns的模拟,5种体系蛋白构象均已基本平稳,证实该模型的合理性。

图3 CALB在不同体系中总能量的变化

图4 CALB在不同溶剂体系中RMSD的变化

2.2 溶剂可及性面积计算

溶剂可及性面积是描述蛋白质亲疏水性的重要参数,它展现了蛋白在溶剂中暴露程度。氨基酸残基越暴露,其发生化学修饰的可能性也越高。研究证实,赖氨酸的氨基溶剂可及性面积越大,相应的赖氨酸残基侧链ε-氨基反应活性也越大[28-29]。脂肪酶CALB的主链中含有9个赖氨酸残基,主链的构象、周围残基侧链及溶剂体系环境的影响使其可及性面积存在一定的差别。经过20 ns的模拟,用Gromacs中自带SASA分析命令进行解析,结果如表1所示。由表1可知,在不同体系中CALB的溶剂可及性面积明显不同,相同类型组成的离子液体受其构型的影响,L型离子液体修饰后的总可及性面积要高于D型离子液体修饰后的可及性面积。当构型相同时,含咪唑阳离子的离子液体具有更强的疏水性,可以促使蛋白质更大程度的开放,因此总可及性面积更大。从表1中可以看出,赖氨酸残基的可及性面积与其所处的位置也有关,处于主链两端的赖氨酸残基可及性面积相对较大,越接近中心的残基可及性面积越小,由于CALB的9个赖氨酸残基几乎都分布在蛋白表面,这些残基的最小可及性面积都在0.4 nm2以上,因此认为,这些位点都可能发生修饰,为了准确寻找离子液体与CALB的结合位点,需要对氨基酸残基进行进一步分析。

表1 赖氨酸残基的溶剂可及性面积

2.3 键占据对修饰位点的影响

单一地考察氨基的溶剂可及性面积很难确定化学修饰的修饰位点,需要更深入地分析残基。通过模拟研究赖氨酸残基与周围残基的位置关系以及是否存在相互作用,能够判断其能否被修饰。蛋白质表面的残基最易受到氢键和盐桥的影响,因此可以通过分析在20 ns内,蛋白中形成这两种键的残基及数目,研究是否存在“键占据”现象。随着分子动力学模拟的不断进行,在不同时间下,CALB蛋白的展开程度存在明显不同,在轨迹后半段10～20 ns中共提取10 000帧的分子坐标结构,通过分析存在氢键和盐桥的帧数来判断赖氨酸残基的占据率。

2.3.1 氢键的影响

CALB蛋白表面氨基酸与周围氨基酸可形成不同程度的氢键,这会影响赖氨酸侧链氨基的修饰。赵军等[29]的研究表明,当赖氨酸与周围氨基酸形成较强作用的氢键时,发生化学修饰的几率将大大降低。CALB蛋白表面赖氨酸受结构变化的影响,有一定的机率与周围的残基形成氢键,进而导致修饰位点被占据,难以发生修饰。表2为CALB在5种体系中形成氢键的帧数与提取帧数的比率,由表2可知,当提取的10 000帧中出现氢键的帧数有2 000帧时,该残基位点就很难与溶液中的修饰剂反应了,笔者定义超过20%的帧数时,该残基位点容易形成稳定的氢键作用导致难以修饰。经过氢键分析,发现构型相同的[BMIM][N-AC-L-Pro]和[N-AC-L-Pro][Cl]离子液体中易修饰的位点均是Lys98、Lys124、Lys136、Lys290和Lys308这5个位点,而构型相同的[BMIM][N-AC-D-Pro]和[N-AC-D-Pro][Cl]则是Lys98、Lys124、Lys290和Lys308这4个位点,其中Lys136位点在D构型的离子液体中极为容易形成氢键,导致修饰难以发生。

表2 赖氨酸在不同溶剂体系中形成的氢键时间占比

2.3.2 盐桥的影响

蛋白质中的赖氨酸残基容易与周围酸性氨基酸(Asp或Glu)形成盐桥,进而影响修饰剂的引入。Shuvaev等[30]对载脂蛋白进行糖基化时发现,Lys75位残基与Glu79残基之间存在盐桥作用,导致糖基化难度增加。同样的,O’Brien等[31]探究乙二醇修饰辣根过氧化物酶(HRP)的修饰位点发现,Lys65与Lys149分别与附近的Glu64与Asp258形成盐桥,虽然Lys65与Lys149这两个赖氨酸的溶剂暴露程度较高,但是由于盐桥作用导致这两个赖氨酸不容易被修饰。根据上述盐桥可能影响赖氨酸的氨基反应活性的观点,对离子液体体系环境下的CALB赖氨酸残基形成的盐桥进行分析。表3为在20 ns内,CALB在不同体系中形成盐桥的情况。由表3可知,受赖氨酸残基周围酸性氨基酸的数目限制,形成的盐桥数目并不多。其中Lys98位残基虽然具有较高的可及性面积以及较少的氢键作用,但是容易与邻近的Asp126位残基形成盐桥,导致其不被修饰。

表3 赖氨酸在不同溶剂体系中形成的盐桥

通过动力学模拟,结合溶剂可及性面积与“键占据”作用分析,确定了在Lys残基在4种离子液体中容易被修饰的位点,其中修饰剂的构型对修饰位点具有一定的影响,L构型离子液体中有4个易修饰位点,D构型的离子液体中有3个易修饰位点,如图5所示。由图5可知,CALB经过L构型离子液体修饰的位点为Lys124、Lys136、Lys290以及Lys308,D构型离子液体修饰的位点为Lys124、Lys290和Lys308,预测的结果与前期肽谱解析一致[13]。

图5 预测离子液体中CALB的修饰位点

1)根据残基在溶剂中越暴露,越容易被修饰的原则,利用分子模拟手段分析了CALB在不同溶剂体系的赖氨酸残基的SASA,由于CALB的赖氨酸残基几乎都分布在酶蛋白表面,暴露程度都较高,因此初步认为这些位点都可能发生修饰。

2)单一的可及性面积分析并不能准确地确定修饰位点,进而又引入氢键以及盐桥这两个影响不同位点赖氨酸修饰难易程度的因素,进一步排除了反应活性较低的氨基酸,在[BMIM][N-AC-L-Pro]和[N-AC-L-Pro][Cl]体系中酶蛋白因键占据难以被修饰的位点为Lys13、Lys32、Lys208、Lys271和Lys98,[BMIM][N-AC-D-Pro]和[N-AC-D-Pro][Cl]体系难以被修饰的位点为Lys13、Lys32、Lys208、Lys271、Lys136和Lys98。

3)结合溶剂可及面积与氢键、盐桥两个影响赖氨酸修饰难易程度的因素,最终筛选确定了4种离子液体化学修饰南极假丝酵母脂肪酶B的修饰位点,[BMIM][N-AC-D-Pro]和[N-AC-D-Pro][Cl]修饰CALB最有可能的位点为Lys124、Lys290和Lys308,[BMIM][N-AC-L-Pro]和[N-AC-L-Pro][Cl]修饰CALB最有可能的位点为Lys124、Lys136、Lys290及Lys308,预测的位点与肽质量指纹图谱结果一致。本工作证明了分子模拟技术预测修饰位点,理性指导脂肪酶化学修饰的可行性,为高效实现脂肪酶催化性能的全面提升奠定了基础。

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