响应面优化超声波微波协同提取灵芝子实体多糖工艺

张柳莲，黄清铧，王丽宁，马年方，梁磊，王庆福*

1. 广东省科学院生物与医学工程研究所，广东省植物纤维综合利用工程技术研究开发中心，广东省生物质高值化利用工程实验室，广州市植物纤维综合利用重点实验室，药食同源功效成分研发与应用协同创新中心，药食同源崖柏精油产业化研究工程中心（广州 510316）；
2. 广东省科学院（广州 510316）

灵芝（Ganoderma lucidum）为担子菌纲多孔菌目多孔菌科（Polyporaceae）灵芝属（Ganoderma）[1]，古籍记载灵芝具有“善养心神，增智慧不忘”的功效[2]，现代医学研究发现，灵芝具有提高免疫力[3-4]、抗肿瘤[5]、抗炎症[6]、抗衰老[7]和抗动脉粥样硬化[8]等方面功效，是真菌类保健食品市场的主要品种。灵芝多糖是灵芝的主要活性物质，传统的灵芝多糖提取法主要有热水浸提法[9]、微波法[10]、超声波法[11]等，但这些传统提取方法存在提取时间长、提取率较低等缺点。利用超声波和微波在天然产物提取方面的优势，通过单因素试验及响应面设计试验，以多糖提取率为指标，探究微波功率、超声波功率、料液比对多糖提取率的影响，优化灵芝子实体多糖的微波-超声波协同提取工艺，以期为灵芝多糖高效提取提供理论依据。

1.1 仪器与试剂

灵芝子实体（采用纯甘蔗渣栽培所获得子实体）；
无水乙醇、苯酚、浓硫酸等（均为国产分析纯）。

XH-300U电脑微波超声紫外光组合催化合成仪（北京祥鹄科技发展有限公司）；
PLC017台式高速冷冻离心机（广州市得菲科学仪器有限公司）；
722G紫外可见分光光度计（上海仪电分析器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 多糖含量测定

多糖含量测定方法采用苯酚硫酸法，参照S/N 4260—2015《出口植物源食品中粗多糖的测定 苯酚-硫酸》。标准曲线的制备：分别精密吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL于10 mL 100 mg/L的葡萄糖标准溶液具塞试管中，用蒸馏水补齐至1.0 mL，加入1 mL 5%苯酚溶液，快速加入5 mL硫酸，静置10 min后摇匀，置于30 ℃水浴中反应20 min，在490 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线y=0.723x-0.002 8，R2=0.999。

1.2.2 不同提取方法比较

微波-超声协同波提取法：提取温度90 ℃、提取时间20 min、料液比1∶40（g/mL）、微波功率300 W、超声波功率500 W。热水浸提法：提取温度90℃、提取时间2 h、料液比1∶40（g/mL）、提取次数2次。超声波提取法：超声功率500 W、超声时间40 min、料液比1∶40（g/mL）、提取次数2次。微波提取法：微波功率400 W、微波时间20 min、料液比1∶40（g/mL）、提取次数2次。提取结束后，以8 000 r/min离心10 min，提取液定容到100 mL，取5 mL滤液加入4倍体积的无水乙醇，以8 000 r/min 离心10 min，弃上清液，沉淀加5 mL水溶解，即得灵芝粗多糖提取物，备用。

1.2.3 单因素试验

按照1.2.2的基础提取参数，研究不同超声功率、微波功率、提取时间、提取次数、提取温度、料液比等因素条件对灵芝总多糖提取率的影响，各因素水平分别为料液比（1∶20，1∶30，1∶40，1∶50和1∶60 g/mL）、提取时间（10，20，30，40和50 min）、提取温度（50，60，70，80和90 ℃）、超声波功率（200，400，600，800和1 000 W）、微波功率（100，300，500，700和900 W）、提取次数（1，2，3和4次）。提取结束后，以8 000 r/min离心10 min，收集滤液备用。

1.2.4 响应面优化灵芝子实体多糖提取试验

结合单因素试验结果，应用Box-Behnken的中心组合试验设计原理，根据单因素试验结果，对试验结果影响较大的因素进行优化试验，分别选取超声波功率（500，600和700 W）、微波功率（200，300和400 W）、料液比（1∶30，1∶40和1∶50 g/mL）三因素三水平设计响应面试验，每个自变量的低、中、高试验水平分别以-1，0和1进行编码，以灵芝总多糖提取率为响应值优化灵芝子实体多糖提取条件。

2.1 不同提取方法比较

微波-超声协同波提取法与超声波提取法、热水提取法、微波提取法相比较结果见表1。微波-超声波协同提取法对灵芝子实体总多糖的提取率最高，为23.89 mg/g，且提取时间最短，说明该提取方法的提取效果显著优于其他3种提取方法。

表1 不同提取方法对灵芝子实体多糖提取率的影响

2.2 单因素试验结果

由图1单因素提取试验结果可知，灵芝总多糖提取率随着超声波功率提高而快速升高，功率大于600 W时，继续提高超声波功率，总多糖提取率逐步下降，可能是由于超声波功率过高使得部分多糖被打断成小分子，在醇沉过程被去除，从而导致多糖提取率下降。微波功率100 W时，灵芝总多糖提取率较低，仅为96.98 mg/g，微波功率300 W及以上时，灵芝子实体多糖提取率趋于稳定，多糖提取率在155 mg/g以上，这可能是由于微波功率100 W时，提取温度难以达到设置温度，影响提取效果。提取时间对灵芝子实体多糖提取率具有一定的影响，随着提取时间延长，灵芝子实体多糖提取率逐步升高，提取时间超过30 min时，多糖提取率上升变慢，因此最终选择提取时间30 min。料液比结果显示，多糖提取率随料液比减小先增大后降低，料液比1∶40（g/mL）时，提取率达到最高，为19.08 mg/g。随着提取次数增加，多糖提取率逐步提升，提取次数≥2次时，提取率趋于稳定，说明利用超声波微波协同提取多糖提取效率高，由于提取次数对提取率影响较小，选择提取次数2次。单因素结果显示，微波功率、超声波功率和料液比3个因素对多糖提取率影响较大，因此，继续对这3个因素进行响应面试验优化。

图1 单因素试验结果

2.3 响应面优化提取灵芝子实体多糖结果与分析

2.3.1 响应面优化数据模型建立与显著性分析

在单因素试验结果的基础上，利用响应面分析方法对微波-超声波协同提取灵芝总多糖工艺进行优化，试验水平因素设计方案和结果见表2。利用Design-Expert 8.0.6.1软件对表3的数据进行分析处理，并对灵芝子实体多糖提取率响应值与超声波功率（A）、微波功率（B）、料液比（C）3个因素进行回归拟合，建立数学回归模型，各因素对灵芝子实体多糖影响拟合方程为Y=24.56+0.99A+2.81B-0.32C+0.059AB+0.62AC+1.5BC-1.79A2-0.26B2-1.35C2。

表2 响应面法优化试验结果

表3 方差分析

灵芝子实体多糖响应面优化提取试验结果如表2所示。通过方差分析可见（表3），模型具有极显著性线性相关（P值=0.004 8＜0.01），说明试验设计可靠。相关系数R2=0.917 6，说明响应值的改变有91.76%来源于因素变量的改变，即实测值和预测值之间具有较高相关性，方程的拟合度较好，失拟项不显著，所建模型可行。变化系数C.V.=5.06，说明试验具有较高的可信度和精确度，A项（P=0.047 7＜0.05）、B项（P=0.000 2＜0.01）、A2项（P=0.016 0＜0.05）、C2项（P=0.049＜0.05）、BC项（P=0.036 5＜0.05）对响应值的影响达到显著水平，3个影响因素对灵芝总多糖提取率的影响依次为B＞A＞C。

2.3.2 响应面优化分析

通过Design-Expert 8.0.6.1软件分析3个因素之间的交互作用对灵芝子实体多糖提取率影响，用三维响应面曲线和二维等高线图作为回归方程的图解，说明因变量和自变量之间的关系[12]，响应面中等高图直观地反映出各因素交互作用对响应值的影响，圆形表示二因素交互作用不显著，椭圆表示二因素交互作用显著。响应面图与等高线图相对应，响应面图曲面越陡峭，则该因素对响应值的影响越显著[13]。由图2结果可见，料液比和微波功率对灵芝总多糖提取率的响应面等高线显椭圆形，曲面较陡峭，说明两因素交互作用显著。而料液比和超声波功率对灵芝总多糖提取率影响的响应面和等高图显近圆形，说明两因素交互作用不显著。灵芝子实体多糖提取率随液体比例的增加呈先增加后减少的趋势；
提取率随微波功率的变化逐步增加，增加幅度较小；
提取率随超声波功率的增加先增加后减少，从试验结果优化得到超声波功率为638.17 W时提取率达到最大值；
料液比和超声波功率的交互作用与微波功率和超声波功率交互作用相比，前者对提取率的影响大于后者，通过模型计算得到最优提取料液比1∶45.24（g/mL），微波功率400 W；
为方便试验，灵芝子实体多糖最佳提取工艺为超声波功率638 W、微波功率400 W、料液比1∶45（g/mL）、提取温度90 ℃、提取次数2次；
利用最佳工艺提取灵芝总多糖，提取率为26.99±0.71 mg/g。

图2 不同因素交互效应响应面图

利用响应面试验优化一种基于微波-超声辅助工艺的有效提取方法，通过方差分析表明，建立的拟合模型由二次多项式数学表示：Y=24.56+0.99A+2.81B-0.32C+0.059AB+0.62AC+1.5BC-1.79A2-0.26B2-1.35C2。模型的统计分析结果证实试验值的高可靠性和准确性，可用于优化、确定最佳提取条件：超声波功率638.17 W，料液比1∶45.24（g/mL），微波功率400 W，提取温度90 ℃，提取次数2次，提取时间30 min。理论提取率预计为27.62 mg/g，在调节超声波功率638 W和料液比1∶45（g/mL）条件下，提取率为26.99 mg/g，与模型预测结果相近，说明所建模型与采用的优化方法可靠，适用于灵芝子实体多糖的提取工艺优化和分析。

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