养精胶囊通过LncRNA,H19调控StAR促进睾酮合成的实验研究※

王丹丹 金保方 邢栋 刘媛媛 蔡滨 邓伟民 崔毓桂 孙大林▲

睾酮（Testosterone，T）是由睾丸和肾上腺产生的雄激素，对肌肉、骨骼、毛发以及性功能都有影响。睾酮水平降低会产生乏力、注意力不集中、抑郁、性欲低下和勃起功能障碍等症状。外源性补充睾酮是目前临床常用的治疗方法，但其不良反应多，且会降低男性精子生成和生育能力[1]。其中，游离睾酮（Free testosterone，FT）代表雄激素的活性形式[2]。

长链非编码RNA（Long noncoding RNAs，LncRNAs）是一类不具备蛋白翻译功能、长度超过200个核苷酸的转录本。LncRNA H19位于人类第11号染色体，全长2.3 kb。研究[3-4]发现，H19可以促进类固醇急性调节蛋白（Steroidogenic Acute Regulatory Protein，StAR）表达和睾酮的生成。StAR是类固醇激素生成的关键酶，可以将胆固醇从线粒体外膜转运至线粒体内膜[5]，随后经过线粒体、内质网中相关酶的催化进而转化为睾酮。

养精胶囊是用于睾酮低下引起性功能障碍及男性不育的医院制剂。笔者团队前期研究[6-7]发现，养精胶囊能够提高StAR启动子活性从而增加睾酮合成，但关于其上游的调控机制仍不明确。由于H19在睾酮合成中具有重要作用，养精胶囊可能是通过LncRNA H19调控StAR进而发挥作用，但目前尚无相关报道。本研究旨在进一步探索养精胶囊对LncRNA H19表达的影响，探讨其促进睾酮合成的机制，具有重要意义。

1.1 细胞株与细胞培养小鼠间质细胞（Leydig细胞）系MLTC-1，购于上海中国科学院细胞库，用RPMI-1640培养基（凯基生物，KGM31800-500），加入10%胎牛血清（ScienCell，0500）配成完全培养基，培养于37 ℃、5% CO2培养箱。

1.2 实验药物养精胶囊（由淫羊藿、熟地黄、紫河车、沙苑子、黄精、牡蛎、当归、黄芪、王不留行、水蛭、荔枝核按1：1：1：1：2：2：1：2：2：1：1组成）来自南京军区总医院制剂科〔院临（2004）第01002号〕，其水提物提取方法见参考文献[7]。实验时用RPMI-1640培养基按比例稀释为低、中、高3种浓度梯度，分别相当于生药量0.01 mg/mL、0.1 mg/mL、1 mg/mL。

1.3 主要试剂0.25%胰蛋白酶-EDTA（Gibco，2186976）；
磷酸盐缓冲液（Servicebio，G4202-500ML）；
RNA快速提取试剂盒（ES Science，RN001）；
焦碳酸二乙酯水（Beytime，R0021）；
PrimeScript™ RT Master Mix（Takara，RR036A）；
TB Green® Premix Ex Taq™（Takara，RR420A）；
RIPA裂解液（Thermo，#89900）；
蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（Thermo，VB298680）；
BCA蛋白浓度测定试剂盒（Beytime，P0010）；
Laemmli样品缓冲液（Bio-rad，#161037）；
SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（Beytime，P0012A）；
PageRuler™ Prestained Protein Ladder,10 to 180 kDa（Thermo，26616）；
StAR Polyclonal antibody（Proteintech，12225-1-AP）；
β-actin抗体（Proteintech，20536-1-AP）；
山羊抗兔IgG辣根过氧化物酶标记（Abcam，ab7090）；
通用型抗体稀释液（新赛美，WB500D）；
超敏化学发光检测试剂盒（US EVERBRIGHT INC，S6009）；
小鼠睾酮ELISA试剂盒（上海纪宁，A00550）；
小鼠游离睾酮ELISA试剂盒（上海纪宁，JN17549-S）。

1.4 实验仪器超净台；
培养箱；
台式冷冻离心机（Eppendorf AG，5404）；
核酸蛋白测定仪（Eppendorf AG，6132）；
PCR仪（applied biosystems，9902）；
StepOnePlus实时荧光定量PCR 系统（applied biosystems）；
酶标仪（Thermo，1510）；
垂直电泳系统（Bio-rad，PowerPac™ Basic）；
曝光机（Tanon，5200）。

1.5 药物干预及分组6孔板内接种2×105个/孔细胞数，待细胞生长至对数期，分别加入2 mL的培养基以及终浓度为0.01 mg/mL、0.1 mg/mL、1 mg/mL的养精胶囊水提物，并将其分别作为对照组和养精胶囊低、中、高剂量组。

1.6 观察指标

1.6.1 细胞上清T和FT浓度 上药处理24 h后，胰酶消化细胞2 min，完全培养基中和，再1000 g离心20 min，取上清。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测，按照ELISA试剂盒说明书操作，最后用酶标仪在450 nm波长处测定各孔的OD值，计算细胞上清中T和FT浓度。

1.6.2 mRNA相对表达量 采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测。用试剂盒提取细胞总RNA，之后用核酸蛋白测定仪检测RNA浓度，随后用逆转录试剂盒合成cDNA，最后以cDNA为模板进行扩增。所用引物由南京锐真生物技术有限公司设计并合成，详见表1。根据试剂盒说明书进行加样操作，反应采用标准两步法，以2-△△CT法计算mRNA的相对表达量[8]。

表1 H19、StAR、β-actin引物序列

1.6.3 StAR蛋白水平 采用蛋白质免疫印迹（Western Blot）进行检测。胰酶消化细胞离心去上清后，加入RIPA Buffer裂解细胞，选择BCA法测定细胞蛋白浓度，确定上样量30 μg，加入2×上样缓冲液，煮蛋白制样；
制备10% SDS-PAGE凝胶，上样后电泳（压缩胶80 V、分离胶120 V），随后用PVDF转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入StAR抗体（1:1000）、β-actin抗体（1:2000）后于4 ℃冰箱过夜，TBST洗膜后加入HRP标记的兔二抗（1:5000）室温孵育1 h，最后加显影液曝光。

1.7 数据统计所有数据采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 8.0.2进行统计分析。各组计量资料采用均数±标准差（）表示。符合正态分布的两组定量数据，采用双尾t检验。P＜0.05认为差异具有统计学意义。

研究结果均为至少进行三次独立重复实验所得。

2.1 养精胶囊处理MLTC-1后细胞上清T和FT水平的变化ELISA检测结果表明，养精胶囊高剂量组可提高MLTC-1细胞上清睾酮浓度（见图1A）和游离睾酮浓度（见图1B），与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 养精胶囊对MLTC-1细胞上清T和FT水平的影响

2.2 养精胶囊处理MLTC-1细胞后StAR mRNA和蛋白水平的变化qRT-PCR检测结果表明，养精胶囊各剂量组均能明显提高StAR的转录水平，增加StAR mRNA的表达（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），见图2A。Western Blot检测结果表明，随着养精胶囊剂量的增加，StAR蛋白的表达增加，且低、高剂量组与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01），见图2B。

图2 养精胶囊对MLTC-1细胞中StAR mRNA和蛋白的影响

2.3 养精胶囊处理MLTC-1细胞后LncRNA H19 mRNA水平的变化qRT-PCR检测结果表明，随着养精胶囊剂量的增加，H19 mRNA的表达上调，且养精胶囊中、高剂量组能够显著提高H19的转录水平，增加H19 mRNA的表达，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。

图3 养精胶囊对MLTC-1细胞中LncRNA H19 mRNA的影响

睾酮大部分由睾丸Leydig细胞分泌，并受下丘脑-垂体-性腺轴的负反馈调节。Leydig细胞位于生精小管之间的间质内，在垂体分泌的黄体生成素刺激下产生睾酮，进而维持男性第二性征并调节男性生殖功能。总睾酮包括游离睾酮和与蛋白质结合的睾酮，后者可与性激素结合球蛋白（sex hormone-binding globulin，SHBG）高亲和力结合，与白蛋白、皮质类固醇结合球蛋白及类黏蛋白（orosomucoid，ORM）低亲和力结合。其中，与白蛋白低亲和力结合的睾酮容易发生解离，与游离睾酮共同构成生物可利用睾酮，在雄激素依赖性靶组织中具有生物活性。未与任何血浆蛋白结合的循环睾酮部分称为游离睾酮。由于SHBG水平随着年龄的增长而增加，因此与年龄相关的游离睾酮水平下降幅度大于总睾酮水平下降幅度。研究[9]显示，游离睾酮与迟发性性腺功能减退症的相关性强于总睾酮。然而，游离睾酮目前的测定方法缺乏标准化，通过SHBG、白蛋白和总睾酮计算游离睾酮是相对准确的[10]。采用ELISA测定游离睾酮，虽缺乏一定的准确性，但亦能在一定程度上说明问题[11]。

LncRNA H19是目前已报道的少数印迹基因之一，在进化上高度保守。胚胎发育期，H19在内胚层和中胚层组织中高度表达，出生后主要在骨骼肌、心肌、乳腺、卵巢、子宫和睾丸中表达。H19在肿瘤进展、能量代谢和机体生长发育等方面发挥重要作用[12]。近年来，多项研究报道了H19在类固醇激素合成方面的作用，发现H19内含4个microRNA Let-7的结合位点，可以像“分子海绵”一样通过结合“吸附”Let-7，抑制其功能[13]，进而解除翻译抑制和mRNA激活，从而促进靶基因StAR的表达和孕酮的生成[14]。Chen等[4]通过敲除雌性小鼠卵巢组织内H19基因，导致类固醇合成酶CYP17和睾酮的合成均显著下调，证实了H19在调控睾酮合成方面具有重要作用。

养精胶囊是基于中医“肾藏精，主生殖”理论，结合肝肾同源、精血互生的思路而设，具有益肾养精、补血活血的功效。养精胶囊由淫羊藿、熟地黄、紫河车、沙苑子、黄精、牡蛎、当归、黄芪、王不留行、水蛭、荔枝核组成。其中，淫羊藿性温，味辛、甘，可补肾温阳、强筋散湿；
熟地黄性温，味甘，可益精填髓、滋阴补血，两者均入肝肾经，阴阳双补，互生互化，共为君药。紫河车补肾填精、益气养血；
黄精健脾补肾、气阴双补；
沙苑子益肾养肝、固精明目；
牡蛎潜阳补阴，重镇安神；
黄芪、当归补气养血，以充化肾精，有养血生精之功，共为臣药。王不留行、水蛭和荔枝核共用以疏肝行气、活血化瘀，为佐药。全方有益肾养血活血之效，临床可用于治疗睾酮低下引起的男性不育症和勃起功能障碍。

前期临床研究[15-17]表明，养精胶囊可以显著提高人体的血清睾酮水平，改善少、弱精子症和无精子症患者的精子数量和质量。动物实验[18,19]表明，养精胶囊可促进老年鼠睾酮的分泌，提高睾丸的脏器指数，以及精囊的分泌功能，增加精液量。体外细胞实验[6,7,20]结果表明，养精胶囊水提液可以通过提高Leydig细胞中StAR的启动子活性，上调其转录和蛋白质水平的表达，提高细胞上清睾酮含量。基于前期的研究基础以及H19调控类固醇合成酶和睾酮生成的作用，笔者团队进一步研究养精胶囊对H19表达的影响，进而探索其促进睾酮合成的机制，具有一定的延续性和创新性。本研究表明，养精胶囊水提物可以显著提高Leydig细胞上清中睾酮和游离睾酮的浓度，同时还可以明显促进LncRNA H19 mRNA以及StAR mRNA和蛋白的表达。基于H19在睾酮合成中的作用[4]，笔者团队初步认为养精胶囊是通过H19调控StAR来促进睾酮合成的，后期还需通过H19的干扰实验进一步证实。

本结果表明，补肾填精类中药复方养精胶囊可以通过调控LncRNA H19以促进Leydig细胞合成睾酮，这对于阐明补肾填精法多通路改善男性生殖功能的机制，揭示“肾藏精”的科学实质，指导临床治疗睾酮降低引起的生殖疾病，提高男性的生殖健康具有重要意义。

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