茶树捕光色素蛋白复合体基因CsLhcb2的鉴定及低温响应分析

胡志航，秦志远，李静文，杨妮，陈益，李彤，庄静*

茶树捕光色素蛋白复合体基因的鉴定及低温响应分析

胡志航1，秦志远1，李静文1，杨妮1，陈益1，李彤2，庄静1*

1. 南京农业大学园艺学院，茶叶科学研究所，农业农村部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，江苏 南京 210095；

2. 南京农业大学，作物遗传与种质创新利用全国重点实验室，江苏 南京 210095

茶树是我国重要的经济作物之一，其生长和发育过程中会遭受不同逆境影响，导致茶叶产量和品质下降。捕光色素蛋白复合体（Light-harvesting chlorophyll-protein complex）主要影响植物光合效率，在植物适应环境胁迫方面也发挥着重要作用。为研究茶树捕光色素蛋白复合体的特性，从龙井43克隆获得编码捕光色素蛋白复合体基因，分析该基因编码蛋白序列特征、进化树、理化性质、亚细胞定位、二级结构、三级结构及其在4 ℃低温处理的表达情况。结果表明，开放阅读框为798 bp，共编码265个氨基酸；
该基因含有典型的Chloroa-b-bind保守结构域；
与15种植物的LHCB2氨基酸序列进行多重比对，氨基酸序列的相似度达91.32%。进化树分析显示，CsLHCB2与曼陀罗、东南景天、葡萄亲缘关系较近，与麻竹和毛竹亲缘关系较远。CsLHCB2分子量为28 662.77，理论等电点为5.69，属于亲水性蛋白；
亚细胞定位预测结果显示CsLHCB2主要定位在叶绿体中。荧光定量结果显示，可能参与茶树低温胁迫的过程。常温处理条件下，一个光周期（24 h）内的相对表达量呈现先上升，后下降趋势，龙井43和舒茶早在光照处理1 h达峰值，白叶1号在光照处理6 h达峰值；
4 ℃低温条件下，3个茶树品种中的表达均在光照处理12 h达到峰值，舒茶早中表达量较高，分别为龙井43和白叶1号的1.18倍和1.98倍。研究结果为进一步研究茶树捕光色素蛋白复合体在茶树低温响应中的作用提供了参考。

茶树；
捕光色素蛋白复合体；
低温胁迫；
表达分析

茶树[(L.) O. Kuntze]是山茶科（Theaceae）山茶属（）中一种常绿木本植物，是我国重要的经济作物之一。光合作用的利用效率是影响茶树生长发育的重要因子，低温胁迫会影响茶树植株的光合作用和叶绿素生物合成，从而影响植株的正常生长和发育[1-2]。茶树对低温较为敏感，低温胁迫对茶树光合作用有明显的影响[3]。

光捕获是植物光合作用的重要过程，捕光色素蛋白复合体（Light-harvesting chlorophyll- protein complex，LHC）作为高等植物的重要色素蛋白复合体，能够捕获光能并将能量迅速传至反应中心[4]。捕光色素蛋白复合体有两个不同的光能转化系统，分别是光系统Ⅰ捕光色素蛋白复合体（LHCⅠ）和光系统Ⅱ捕光色素蛋白复合体（LHCⅡ）。LHCⅡ由高度保守的亚型组成，所有绿色生物都含有大量的基因[5]。在高等植物中，LHCⅠ和LHCⅡ分别由6个基因编码。LHCⅡ的6个基因分别被命名为LHCⅡb（、、）、LHCⅡa（，又称CP29）、LHCⅡc（，又称CP26）和LHCⅡd（，又称CP24）[6]。目前，基因已在水稻[7]、番茄[8]、东南景天[9]等植物中被克隆出来。

所有含叶绿体的绿色植物都需要进行光合作用，和在光合作用的收集和转化中具有独特的作用[10]。当缺少和时，会导致拟南芥叶绿素含量下降，叶片颜色呈现淡绿色[11]。LHCB家族的成员在植物适应环境胁迫方面发挥着重要作用。LHCB成员的下调降低了植物对环境胁迫的耐受性，降低种子产量[12]。Xu等[13]研究表明，LHCB家族成员的下调会导致拟南芥对干旱胁迫的耐受性降低。Lucinski等[14]将拟南芥叶片暴露于寒冷下，导致和表达逐渐降低。同时低温胁迫会影响到Rubisco活性的丧失，导致基因表达下降，从而抑制光呼吸[15]。现阶段，对于茶树中的分子机制及其对低温胁迫的响应机理尚未见报道。

本研究从龙井43克隆获得编码茶树捕光色素蛋白复合体基因，对其核苷酸序列、编码氨基酸序列以及理化性质、进化树和二级、三级结构等进行较为全面的分析，并通过低温处理和利用荧光定量PCR方法分析龙井43、舒茶早和白叶1号中在低温胁迫下的响应情况，旨在为进一步研究在茶树应对逆境胁迫中的作用提供参考。

1.1 试验材料

以龙井43（cv. Longjing 43）、舒茶早（cv. Shuchazao）、白叶1号（cv. Baiye 1）两年生茶树扦插幼苗为试验材料，种植在南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室植物生长室。选取长势一致的茶苗于光照培养箱中[温度25 ℃、光周期12 h/12 h、光照强度240 μmol·m-2·s-1、湿度(70±10)%]，培养1周后，将茶树分在两个光照培养箱中进行室温（25 ℃）和低温胁迫处理（4 ℃）。于上午9时开始处理，此时光照开始0 h，初始时间记为0 h，之后分别在1、3、6、12、24 h取样。分别摘取3个茶树品种的一芽二叶，用锡纸包裹并迅速用液氮冷冻，并在–80 ℃下保存，用于之后的试验，每个材料设置3个生物学重复。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取及cDNA的合成

使用RNA提取试剂盒（RNA simple total RNA Kit，北京Tiangen公司）提取茶树叶片总RNA，使用微量紫外检测仪Nanodrop ND-1000（上海谱元仪器有限公司）测定RNA样品的浓度，采用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量[16]。利用反转录试剂盒（大连TaKaRa公司）将提取茶树叶片的总RNA反转录成cDNA。

1.2.2的克隆

根据已报道的水稻基因的核苷酸和氨基酸序列分析，从茶树基因组数据库（tpdb.shengxin.ren/index.html）中鉴定并获得茶树基因。利用软件Primer Premier 6.0设计一对引物CsLhcb2-F和CsLhcb2-R（表1），对进行扩增。PCR扩增体系为CsLhcb2-F/R引物各1.5 μL、2×Plus Master Mix酶15 μL、cDNA模板1.5 μL和ddH2O 10.5 μL。PCR的扩增程序为95 ℃预变性5 min；
94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸75 s，共35个循环；
72 ℃延伸10 min。用1.2%的琼脂凝胶电泳对扩增产物进行检测，胶回收后送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。

表1 本文涉及引物

1.2.3 生物信息学分析

对于故障码“B116854 转向角传感器，无基本设置主动/静态”，说明需要对转向角传感器进行基本设置，具体操作方法如下：

利用BioXM 2.6获得编码的氨基酸序列，在NCBI网站（www.ncbi.nlm. nih. gov）用BLAST进行同源性分析和保守域预测。利用DNAMAN 6.0软件对蛋白质的亲水性、疏水性和氨基酸序列的多重比对进行分析。使用SMS在线网站（http://www.bio-soft. net/sms）和ExPASy-ProtParam （http://web. expasy.org/protparam）对氨基酸组成成分及理化性质进行分析。利用MEGA 7.0软件构建进化树。蛋白亚细胞定位采用LocTree3（https://rostlab.org/services/loctree3）和SoftBerryProtComp 9. 0（http://linux1.softberry.com/berry.phtml）预测。通过SOPMA在线软件（https://npsa-prabi.ibcp.fr）对CsLHCB的二级结构进行预测和分析，并用Swiss-Model（http://www. Swissmodel.expasy.org）构建了CsLHCB的三级结构模型；
通过STRING在线软件（https://string-db.org），预测CsLHCB2潜在的互作关系；
在TPIA数据库中（http://tpia. teaplant.org）下载的表达量（TPM）以及非生物胁迫下在茶树中的表达量（TPM），制作表达热图。

1.2.4的表达分析

1.3 数据处理及分析

使用Microsoft Excel 2019软件进行数据整理。差异显著性使用IBM SPSS Statistics 25.0进行分析，采用Duncan′s进行多重比较（＜0.05），并使用Origin 8.0软件完成图表制作[19]。

2.1 CsLhcb2的测序分析

以龙井43幼苗叶片的cDNA为模板，通过引物CsLhcb2-F和CsLhcb2-R进行PCR扩增，获得800 bp左右的扩增片段。扩增片段测序结果显示，基因含有1个长798 bp的开放阅读框，编码265个氨基酸（图1），GenBank登录号为XP_028051827.1。

2.2 茶树CsLHCB2进化树分析

除了CsLHCB2外，选取了水稻（）、小麦（）、麻竹（）、毛竹（）、拟南芥（）、东南景天（）、绿藻（）、木瓜（）、蓖麻（）、曼陀罗（）、谷子（）、香瓜（）、南瓜（）、黄瓜（）、葡萄（）等15个物种的LHCB2构建进化树（图2）。研究结果显示，CsLHCB2与曼陀罗、东南景天和葡萄亲缘关系较近，与麻竹和毛竹亲缘关系较远。

2.3 CsLHCB2的氨基酸序列比对

对CsLHCB2编码的氨基酸序列进行分析，结果显示，CsLHCB2在3～265位氨基酸间含有典型的Chloroa-b-bind结构域（图3A）。将CsLHCB2与水稻、小麦、麻竹、毛竹、拟南芥、东南景天、绿藻、木瓜、蓖麻、曼陀罗、谷子、香瓜、南瓜、黄瓜、葡萄的LHCB2氨基酸序列进行多重比对，结果显示氨基酸序列的相似度高达91.32%（图3B）。

2.4 CsLHCB2的理化性质分析

由表2结果显示，CsLHCB2的分子量为28 662.77，理论等电点为5.69，总平均疏水性为–0.037。不同植物中的LHCB2蛋白残基数在254～265，分子量在26 948.72～28 662.77，理论等电点为5.13～5.69，酸性氨基酸多于碱性氨基酸，脂肪族氨基酸多于芳香族氨基酸，总平均疏水性在–0.118～–0.001，表现出较为明显的疏水性。

注：ATG为起始密码子，*为终止密码子

图2 不同植物LHCB2的进化树分析

图3 CsLHCB2的保守域（A）与其他物种氨基酸序列的多重比对（B）

表2 不同植物中LHCB2氨基酸组成成分及理化性质分析

2.5 CsLHCB2亚细胞定位预测和氨基酸亲/疏水性分析

表3的预测结果显示，CsLHCB2蛋白主要定位在叶绿体中。在线预测网站PSORT对CsLHCB2亚细胞定位预测和分析，结果与SoftBerry ProtComp 9.0一致，由此推断，CsLHCB2主要在叶绿体中起生物学作用。对氨基酸亲/疏水性进行了分析。结果显示，CsLHCB2蛋白疏水性最强的位点是在第168位的甲硫氨酸（Met），其次是第167位的亮氨酸（Leu）；
亲水性最强的位点是在第95位的精氨酸（Arg），其次是第212位的赖氨酸（Lys）。总平均疏水性为负值，属于亲水性蛋白。

表3 CsLHCB2蛋白亚细胞定位预测

2.6 CsLHCB2的二级、三级结构分析

二级结构预测表明，CsLHCB2由39.62%的-螺旋（Alpha helix），5.28%的延伸主链（Extended strand），5.28%的-转角（Beta turn）和49.81%的随机卷曲（Random coil）组成。以Green algae Light-Harvesting Complex（PDB ID：7dz7.1）为模型，使用Swiss-Model软件对拟南芥AtLHCB2和茶树CsLHCB2进行三级结构建模比较分析，结果表明，CsLHCB2主要是由-螺旋和随机卷曲组成，AtLHCB2和CsLHCB2的差异位点共有9个，其中-螺旋上有5个差异位点，分别位于206（A）、101（O）、197（G）、112（V）和162（C）。总的来说，AtLHCB2和CsLHCB2结构较为相似，保守域相对保守，预测结果与二级结构相吻合（图4）。

2.7 CsLHCB2互作预测与分析

利用STRING在线网站以拟南芥AtLHCB2为参考，预测CsLHCB2潜在的互作关系。结果发现（图5），CsLHCB2与PSAG（Photosystem Ⅰ reaction center subunit G）、PSAO（Photosystem Ⅰ reaction center subunit O）、LHCB2.2、LHCB2.3关系较为直接。NPQ4、LHCB5与其他蛋白联系较为密切，可能在光捕获过程中具有重要作用。

2.8 CsLhcb2表达模式分析

为了进一步了解在茶树中的表达情况，将TPIA数据库中下载的表达量数据使用TBtools软件制作热图并进行分析（图6），结果显示，在果实和嫩叶中的表达量较高，在花和根中的表达量较低（图6A）。同时，对在4种非生物胁迫处理下的数据进行分析，在自然冷驯化过程中，在冬季的表达量较低，在来年春天脱驯化阶段表达量升高（图6B）；
在干旱处理和盐胁迫处理下，表达量随着时间的增加而逐渐降低（图6C、6E）；
在茉莉酸甲酯处理12 h时，的表达量升高，随着时间的增加，基因的表达量逐渐降低（图6D）。

2.9 CsLhcb2在低温胁迫下的表达分析

通过实时荧光定量PCR，分析了龙井43、舒茶早和白叶1号在4 ℃低温胁迫条件下的表达情况。如图7所示，常温处理条件下，一个光周期（24 h）内，的相对表达量呈现先上升，后下降趋势，龙井43和舒茶早的相对表达量在光照处理1 h（10﹕00）达峰值，白叶1号的相对表达量在光照处理6 h（15﹕00）达峰值。4 ℃低温条件下，3个茶树品种中的表达量均在光照处理12 h达峰值，此时舒茶早的表达量较高，分别为龙井43和白叶1号的1.18倍和1.98倍（图7D）。在4 ℃低温胁迫处理下，龙井43、舒茶早和白叶1号中的表达量趋势基本一致。

图4 茶树CsLHCB2的三级结构预测

注：A为不同组织，B为冷处理，C为干旱处理，D为茉莉酸甲酯处理，E为盐处理

图5 茶树CsLHCB2蛋白互作预测与分析

茶树是一类喜温惧寒的作物，受低温影响较大。低温胁迫等非生物胁迫是影响茶树生长发育重要的环境因素之一，茶树遭遇非生物胁迫时，其逆境响应相关结构基因和转录因子基因会被诱导，使得茶树植株能够抵御非生物胁迫[20-22]。当植物遭受冻害时，会破坏叶绿体的结构从而影响光合作用，引起光系统Ⅱ的光抑制[23]。邓永胜[8]利用Southern杂交、Northern杂交和荧光定量试验分析番茄会被低温诱导，并在番茄叶片中表达量最高。LHCB家族成员在植物适应环境胁迫方面发挥着重要作用，研究捕光色素蛋白复合体在茶树低温胁迫响应中的作用具有重要的意义。本研究分别对2个绿叶茶树品种（龙井43、舒茶早）和1个白叶茶树品种（白叶1号）进行低温胁迫处理，结果表明3个茶树品种中的表达量趋势基本一致，其中龙井43和舒茶早中表达量较高，白叶1号中表达量相对较低。龙井43和舒茶早是耐寒性较强的品种，高表达可能与茶树的耐寒性相关[24]。编码捕光色素蛋白复合体的基因家族表达也受生物钟的调节。与常温样品（CK）表达量进行比较，白天时间段茶树品种的表达量存在一定的差异，说明低温胁迫影响了茶树的表达。

本研究对CsLHCB2蛋白的氨基酸组成、亲疏水性、二三级结构进行分析，结果显示CsLHCB2蛋白属于亲水性蛋白，并与其他植物中的LHCB蛋白序列相似性高达91.32%。LHCB基因家族与叶绿素含量和植物光合作用关系密切[7,13]，亚细胞定位预测结果显示CsLHCB2蛋白主要定位在叶绿体中，与蛋白预测的功能相吻合。在高等植物中，叶绿素含量与植株的光合作用密切相关，叶绿素含量降低会导致作物产量减少[25]。细胞核和叶绿体之间的两个中枢信号整合因子（GLK1和LHCB）对遮阴表现出明显的响应，表明光在调节茶树叶绿体发育中起着至关重要的作用[26]。龙井43和舒茶早作为绿叶茶树品种，叶绿素含量较白叶茶树品种白叶1号高，也验证了参与光的调控。

注：A，龙井43；
B，舒茶早；
C，白叶1号；
D，4 ℃处理下不同品种差异。不同小写字母表示在0.05水平有显著差异

基因还受多种因素的调节，包括生物钟[27]、温度[28]、脱落酸[29]、渗透胁迫[30]等。Paulsen等[27]以烟草为试验材料，发现捕光复合物蛋白（LHCP）mRNA的水平在昼夜变化中变化很大，这也与本研究结论相符。孙钦秒等[28]在相同的光照下处理豌豆幼苗，结果发现，4 ℃下基因的表达量比25 ℃下的表达量低50%左右。Jiang等[31]对芹菜进行非生物胁迫处理，研究结果发现低温、高温、盐和干旱胁迫对芹菜中的基因表达也产生影响。LHCBs还可能通过调节ROS内稳态参与保护细胞中的ABA信号的传导[28]。卢从明等[30]发现水分胁迫会抑制激发能向PSⅡ传递从而降低捕光色素蛋白复合体的含量。本研究对低温胁迫响应的分析，为进一步深入研究茶树捕光色素蛋白复合体功能提供了参考。

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Identification of the Light-harvesting Chlorophyll-protein Complex Geneand Its Response to Low Temperature in Tea Plants

HU Zhihang1, QIN Zhiyuan1, LI Jingwen1, YANG Ni1, CHEN Yi1, LI Tong2, ZHUANG Jing1*

1. Ministry of Agriculture and Rural Affairs Key Laboratory of Biology and Germplasm Enhancement of Horticultural Crops in East China, Tea Research Institute, College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2. National Key Laboratory of Crop Genetics & Germplasm Enhancement and Utilization, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China

Tea is one of the important cash crop in China. Its growth and development will be affected by different adversity, leading to the decline of tea quality and yield. Light-harvesting chlorophyll-protein complex mainly affects the photosynthetic efficiency of plants, and also plays important roles in adaptation to environmental stresses. In order to study the characteristics of the light-harvesting chlorophyll-protein complex in tea plants, the geneencoding the light-harvesting protein complex was cloned from tea cultivar ‘Longjing 43’, and the sequence characteristics, phylogenetic tree, physical and chemical properties, subcellular localization, secondary structure, tertiary structure and its expression profiles under low temperature treatment were analyzed. The results show that the open reading frame ofgene is 798 bp, encoding 265 amino acids. This gene contains a typical of Chloroa-b-bind conservation domain. The similarity of CsLHCB2 amino acid sequence with 15 plant species was 91.32%. Phylogenetic tree analysis shows that the CsLHCB2 protein of tea plant was closely related to,and, and far fromand. The relative molecular weight of CsLHCB2 protein is 28 662.77 and the theoretical isoelectric point is 5.69, which belongs to hydrophilic protein. Subcellular localization prediction results show that CsLHCB2 protein is mainly located in chloroplasts. Quantitative RT-PCR results show thatgene may participate in the process of low temperature stress in tea plants. Under normal temperature treatment, the relative expression level ofgene showed a trend of increasing first and then decreasing within a photoperiod (24 h). ‘Longjing 43’ and ‘Shuchazao’ reached their peak value at 1 h after light treatment, and "Baiyeyihao" reached their peak value at 6 h after light treatment. Under low temperature of 4 ℃ treatment, the expression ofof the three tea cultivars all reached the peak at 12 h of light treatment, among which the expression level ofin ‘Shuchazao’ wasthe highest, which was 1.18 and 1.98 times higher than that of ‘Longjing 43’ and ‘Baiyeyihao’, respectively. The results provided a reference for further research on the role of light-harvesting chlorophyll-protein complex response to low temperature in tea plants.

, light-harvesting chlorophyll-protein complex, low temperature stress, expression analysis

S571.1；
Q786

A

1000-369X(2023)02-183-11

2022-12-09

2023-03-02

国家自然科学基金（31870681）、江苏省政策引导类计划（SZ-LYG202126）、江苏高校优势学科建设项目（PAPD）

胡志航，男，博士研究生，主要从事茶树遗传育种与分子生物学研究。*通信作者：zhuangjing@njau.edu.cn

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