利用Cre-Loxp技术构建标记肝星状细胞的小鼠模型

黄紫薇,赵殿元,徐 龙,唐 丽,

肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)起源于胚胎发育期间的间皮细胞,位于肝窦的内皮下间隙。其特征是存在含有维生素A的脂滴,表达卵磷脂视黄醇酰基转移酶Lrat、结蛋白desmin等[1]。HSC、肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells,LSEC)、肝脏巨噬细胞(Kupffer cells, KC)、肝脏实质细胞(hepatocytes,HC)共同构成肝脏四大细胞群体。Zhou et al[2]观察到HSC与巨噬细胞借助集落刺激因子1、血小板衍生生长因子作用的双向环路稳定细胞种群密度;Bonnardel et al[3]研究表明死亡的Kupffer细胞释放的肿瘤坏死因子激活星状细胞和内皮细胞,免疫细胞及其微环境间的相互作用正被研究者们大量区域化解析中。但由于HSC在肝脏中占比较低,直接分离纯度不高等特点,相关研究常常受限或者鉴定清晰度不高。该研究使用Cre-Loxp技术,将H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato小鼠与LratCre小鼠进行杂交产生新的转基因小鼠,直接定位HSC本身,进而研究肝脏中HSC的分布以及HSC和其他肝脏非实质细胞之间的相互作用情况。

1.1 实验材料

1.1.1实验动物 雄性H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato小鼠(Strain NO.T006163),雌性LratCre小鼠(Strain NO. T006205),体质量均为20～22 g,购自江苏集萃药康生物有限公司,所有小鼠均在北京生命组学研究所SPF级设施内进行饲养,经单位实验动物管理伦理委员会批准(IACUC:20210528-18-MBL)。

1.1.2仪器与试剂 2720 Thermal Cycler PCR仪、凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司),Cryotome FSE型冰冻切片机(美国Thermo公司),超高分辨率共聚焦显微镜成像系统(日本Nikon公司),英国牛津仪器Imaris分析系统。Mouse Tail Direct PCR Kit(成都福际生物技术有限公司),PCR引物(北京华大基因),OCT包埋剂(日本Sakura公司),Hochest染色剂(赛默飞公司),磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)(北京酷来搏科技有限公司),Triton X-100缓冲液和Tween-20缓冲液(北京索莱宝科技有限公司),抗荧光淬灭封片剂(翌圣生物科技有限公司),三溴乙醇(德国Sigma公司)。抗体:desmin(英国艾博抗贸易有限公司),F4/80、CD31-AF647(美国BioLegend生物科技公司)。

1.2 实验方法

1.2.1LratCreH11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato小鼠的构建及鉴定策略 F0代LratCre小鼠与H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato小鼠交配得子代F1(图1)。

图1 LratCre小鼠与H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato小鼠交配得到子代小鼠LratCreH11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato的构建策略

在2周龄时剪脚趾编号,加入直接鼠尾PCR基因组提取试剂,裂解释放基因组,PCR鉴定小鼠基因型。LratCre上游序列:5′-TGAGCCAAGCACTTTGGCTTC-3′;下游序列:5′-TCACATCCTCAGGTTCAGCAGG-3′;反应体系:2 μl引物,2 μl蒸馏水,2 μl鼠尾DNA模板,6 μl Mix;反应条件:94 ℃、3 min;94 ℃、30 s,60 ℃、30 s,72 ℃、30 s,35个循环数;72 ℃、5 min,20 ℃、∞。将PCR产物点样于2.5%琼脂糖凝胶进行电泳,并显影记录。将PCR鉴定得的LratCreH11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato小鼠及其同窝对照H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato小鼠留笼,3周龄时分笼处理,8周龄用作实验对象。

1.2.2肝脏切片样本前处理LratCreH11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato实验小鼠及其同窝对照H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato小鼠称重,用1.2%三溴乙醇腹腔注射麻醉小鼠(500 μl/只)。深度麻醉后,将小鼠固定于解剖台打开腹腔,在心尖处扎入针头,快速注入0.01 mol/L PBS(pH 7.2～7.4)至肝脏变白,同时剪破下腔静脉。用PBS缓冲液灌注约20 ml,取出整个肝组织,4%多聚甲醛磷酸缓冲液固定12 h,之后依次在含15%、30%蔗糖的PBS溶液中沉糖12 h,OCT包埋并于-80 ℃冰箱保存。使用冰冻切片机切片(厚度30 μm),贴片,-20 ℃冰箱保存。

1.2.3免疫荧光法观察肝脏非实质细胞分布 准备试剂:Triton X-100与PBS按照1 ∶500体积比配制(Buffer 1);Tween-20与PBS按照1 ∶500体积比配制(Buffer 2);Buffer 2中按以下终浓度加入其他试剂:甘氨酸(0.3 mmol/L)+牛血清白蛋白(1%)+二抗同源血清(10%)(Buffer 3),4 ℃保存。复温:-20 ℃取出冰冻切片置于湿盒中,用组化笔圈出组织,PBS覆盖组织切片,室温10 min。通透:吸弃PBS,使用Buffer 1覆盖组织切片,室温30 min。封闭:吸走Buffer 1,使用Buffer 3覆盖组织切片,室温2 h。一抗染色:吸弃Buffer 3,将一抗抗体稀释于Buffer 2中,覆盖组织切片,封口膜封片,4 ℃染色12 h。洗涤:PBS洗3次,每次5 min。二抗染色:将二抗稀释于Buffer 2中,室温染色2 h。洗涤。Hoechst染细胞核,覆盖组织切片,室温染色10 min。洗涤:PBS洗3次,每次5 min。封片:滴加约30 μl抗荧光淬灭封片剂,盖玻片封片,使用激光共聚焦显微镜拍照,每层间距1.6 μm,共扫描15层,厚度约24 μm。

1.2.4观察肝脏非实质细胞相互作用 应用Imaris软件对激光共聚焦拍摄原件进行3D渲染,得到约300 μm×300 μm×24 μm的长方体,通过“surface”还原展现细胞原有形态,观察其定位与分布,通过“position of surface statistics”得到x、y、z值。

2.1 构建LratCreH11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato小鼠LratCre小鼠与H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato小鼠交配获得16只子代小鼠。子代小鼠2周龄时剪脚趾编号,提取基因组DNA,经PCR扩增和电泳后,鉴定出LratCre小鼠4只(1、9、12、15),同窝对照小鼠WT小鼠5只(3、7、8、10、11)。已知LratCre扩增条带分子量约391 bp,琼脂糖凝胶电泳结果见图2。根据构建策略,表达LratCre的小鼠亦表达tdTomato,表示为LratCreH11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato小鼠,不表达LratCre的小鼠则表示为H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato。

图2 子代小鼠LratCreH11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato的基因型鉴定结果M:marker;1、3、7、8、9、10、11、12、15:实验小鼠脚号

2.2 HSC表达与共定位分析HSC属于肝脏非实质细胞,被LSEC和HC包围。其形态不规则,胞体呈圆形或不规则形,数个星状胞突的立体分布和伸展足以覆盖整个肝窦微循环。desmin属于第三类中间丝蛋白,是HSC标记蛋白之一。经过免疫荧光染色,可以看到H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato对照小鼠desmin标记情况(图3A),LratCreH11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato实验小鼠desmin与tdTomato共标记情况(图3E)。Hochest染核(图3B、3F);desmin+HSC在肝实质中散在分布(图3D、3H);对照小鼠不表达tdTomato(图3C),实验小鼠tdTomato+可直观表示HSC的分布与大小:多呈红色不规则状圆点样分布,各点周围分别存在无规律的红色丝状线条,符合HSC星状胞突特征(图3G)。

图3 对照小鼠H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato、实验小鼠LratCreH11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato的desmin染色情况

保留实验小鼠desmin与tdTomato共标记视野,观察二者共定位情况(图3I)。借助Imaris软件3D还原图3I各细胞及标志物形态,可以看到,粉红透明的不规则形状代表tdTomato+表示的HSC,绿色散在的不规则椭圆体则为desmin标记的HSC(图3J)。截取诸多HSC中的一个,统计其Imaris上位置参数,分析共定位位点。可以看到tdTomato+HSC重心为X=19 450、Y=2 730、Z=2 068(图3K);desmin+HSC重心为X=19 450、Y=2 726、Z=2 067(图3L),综上,基本认定两种标记方法确认的HSC为同一个细胞,HSC标记的desmin与LratCre诱导的tdTomato+表达基本重叠,则LratCreH11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato报告基因小鼠能够特异性示踪HSC。

2.3 LSEC、HSC表达与分布LSEC是高度特化的内皮细胞,具有特征性的形态和功能,构成网状内皮系统重要组成部分,形成肝脏中最小血管的内层,即肝窦。CD31又名PECAM1,主要在胞质表达,可作为内皮细胞标志。肝窦周隙分布的另一细胞类型HSC,通过释放细胞因子和细胞外基质等成分,可维持肝窦功能和肝脏坚硬度。经过免疫荧光染色,可看到LSEC的区域连结性分布(图4D、4H);Hochest染核(图4B、4F);相比对照小鼠H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato,实验小鼠LratCreH11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato多tdTomato+红色圆点样分布(图4C、4G);同时实验小鼠可以通过HSC自定位,观察其与肝脏非实质细胞之一的LSEC的交互与表达(图4A、4E)。观察实验小鼠CD31与tdTomato+二者相互作用情况(图4I),可以看到HSC胞突缠绕在LSEC之间(图4J),黄色信号即为LSEC与HSC的重合位点,信号的交叠暗示着两种细胞类型存在着较为紧密的相互作用,为定位分析肝脏纤维化的产生与发展提供了思路。

图4 对照小鼠H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato、实验小鼠LratCreH11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato的CD31染色情况

2.4 KC、HSC表达与分布KC是肝窦状隙的非实质细胞,也是肝内重要的天然免疫细胞。Kupffer极化和HSC活化在慢性肝损伤炎症和纤维化的始动和持续过程中发挥重要作用。免疫荧光染色后研究KC、HSC的相互接触与各自分布(图5A、5E),可观察到Hochest染核皆呈深蓝色(图5B、5F);F4/80+标记的绿色KC在肝脏组织中散在分布,细胞形态多不规则(图5D、5H);tdTomato+代表的HSC仍仅存在于LratCreH11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato实验小鼠中(图5G),H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato对照小鼠中不存在Tdtomato的特异性标记(图5C),进一步证实小鼠模型构建成功。且通过KC和HSC的红绿信号共定位可以直接观察到二者非实质细胞间的相互作用(图5I),KC、HSC间的包绕交联是细胞通讯等功能得以发挥的基础(图5J),是研究细胞间表型、功能改变后细胞分布及相互作用的良好模型。

图5 对照小鼠H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato、实验小鼠LratCreH11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato的F4/80染色情况

本实验通过LratCre小鼠与H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato小鼠杂交获得了LratCreH11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato实验小鼠和其同窝对照H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato小鼠,用于HSC与LSEC、KC的定位和互作研究,以及HSC自身荧光标记蛋白desmin的共定位研究。可以观察到:① HSC占肝脏细胞总数的5%～10%[4],多在肝窦间隙中分布,呈梭形或多边形,常伸出数个星状胞突包绕着肝血窦。desmin作为经典的HSC表面标志物之一,被Nitou et al[5]确定其在HSC表达。此外,HSC还伸出胞突与HC、邻近的星状细胞相接触。② LSEC位于肝血窦表面,是肝脏非实质细胞中数量最多的一种细胞,胞质高表达CD31[6]。其缺少基底膜,具有窗孔结构、细胞通透性较高等特点,决定了LSEC与肝脏微环境中各类型细胞的紧密联系[7],实验结果显示部分HSC与LSEC存在空间的交联情况。③ KC形态不规则,常以板状或丝状伪足附着在内皮细胞表面或伸出伪足穿过内皮细胞窗孔或内皮细胞间隙伸至窦周隙[8],CD64、VSIG4和F4/80可作为成熟KC的表面标志物。可直观看到KC、HSC都定位在肝脏窦周隙,存在明显的勾连缠绕,存在相互作用。④ desmin标记的HSC与tdTomato标记的HSC共定位一致,且亦可直观看到tdTomato、desmin的信号交叠,但tdTomato标记的还原度更胜于desmin的胞质蛋白标记,则说明了该工具鼠的适用性较好,清晰度较高。⑤ HSC、LSEC、KC三种细胞类型的免疫荧光染色结果中LratCreH11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato实验小鼠的特定性表达tdTomato证实了该工具鼠构建的成功与特异性。以上全部结果证实该报告基因小鼠可精确示踪HSC的表达与分布,以及表示与KC、LSEC的良好作用关系。

HSC是肝脏纤维化、肝癌等发生发展的重要因素。慢性肝病期间,HSC激活并转分化为肌成纤维细胞的过程,在实验和人类肝损伤中被认为是肝纤维化的中心细胞驱动程序[9]。然而,HSC的一般标记的定义是相当复杂的。实际应用中,围绕HSC自身标志物展开的小鼠模型仍然较少,在之前的研究中,Collagen-driven Cre或者Wt1Cre不能追踪肌成纤维细胞的特定细胞来源或间皮细胞,hGFAPCre小鼠不能有效标记HSC或产生胶原的肌成纤维细胞[10],GFAPCre小鼠靶向HSC的水平较低,以及有关纤维化和HSC衰老在肝癌发生中的争议较多[11]。最终有研究者借助LratCre的新转基因小鼠,证明在中毒性、胆汁淤滞性和脂肪肝疾病模型中,HSC可产生82%～96%的肌成纤维细胞[10]。近期更有研究者证实LratCre小鼠交配Trp53fl/fl或Relafl/fl小鼠后,HSC中Trp53和Rela mRNA水平降低了93%～99%[12]。有关HSC的现有研究中,使用LratCre小鼠进行HSC的敲除或追踪等逐步成为研究者们的共识。

围绕H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato报告基因小鼠,国内研究应用较少,刘慧 等[13]构建Gad2tdTomato/non-Gad2ZsGreen小鼠用于示踪全脑 γ氨基丁酸能神经元分布及形态。本研究借助报告基因小鼠实现了HSC的靶向定位,对照小鼠H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato、实验小鼠LratCreH11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato与不含报告基因的正常小鼠相比,在体质量、体长等方面无明显差异,但外部瞳孔、外耳廓、脚趾皮肤、尾巴皮肤等部位可观察到绿光。打开腹腔后可以发现小鼠肌肉组织、心脏、肝脏、肾脏、肠等均呈现绿色,肠系膜荧光绿色尤为明显。这些大体观察现象与之前相关报道[14]一致。

Cre-Loxp系统生成的小鼠可提供组织或器官中细胞的信息,是了解组织发育、探索调节细胞命运的机制和疾病发生发展的强有力工具[15]。总的来说,LratCre小鼠与H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato小鼠的杂交构建,既保证了HSC标志物应用的典型性,又实现了特异性的荧光表达,可以用做HSC发育分化、稳态维持及功能研究的工具鼠。

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