难治性肺炎支原体肺炎生物标志物研究进展

陶 冶,李 乐,余资笔

(1.上海中医药大学附属曙光医院松江分院儿科;2.复旦大学附属闵行医院儿科,上海 201199)

肺炎支原体(MP)是我国儿童社区获得性肺炎(CAP)的常见病原体之一。ZHU等[1]研究显示儿童和青少年CAP中MP感染率为10%～30%;JAIN等[2]在一项纳入2254例CAP患儿的研究中表明5岁以上儿童MP感染率为19%。虽然肺炎支原体肺炎(MPP)通常被认为是一种自限性疾病,但近年来有些儿童在使用了7 d或更长时间的大环内酯类抗生素后,仍持续发热,临床症状加重,病程延迟同时伴有肺外并发症,影像学征象进展,这些病例被定义为难治性肺炎支原体肺炎(RMPP)[3]。目前,由其导致的支气管黏液栓塞、支原体坏死性肺炎、肺外器官血栓形成、Stevens-Johnson综合征(SJS)等报道逐年增多[4-6]。近期来自苏州大学儿童医院对RMPP流行病学的研究[7]显示其在MPP中的总发生率为14.30%,发生率随年龄增大而逐渐升高(P<0.01)。RMPP的特征在于机体对病原体的过度免疫反应,因此皮质类固醇已被建议作为下调宿主过度免疫反应的免疫调节剂[8]。然而,部分儿童在接受皮质类固醇治疗后继续出现发热持续或影像学恶化,可能导致气管黏液栓形成等,需用支气管镜介入以减少相关后遗症。有研究[8-9]显示在2周内进行皮质类固醇及支气管镜治疗是RMPP的一个保护因素,延迟RMPP有效治疗已被证明与更严重的并发症有关,因此能预测RMPP的生物标志物在病程早期能给临床医生提供有效参考,及时匹配相应治疗防止严重并发症及后遗症发生。本文从RMPP致病机制出发,结合相关文献,对近年来预测RMPP的生物标志物研究进展作一综述。

1.1 免疫逃逸

1.1.1 分子模仿

RMPP的致病机制尚不完全清楚,但MP感染引起的机体免疫功能紊乱在其中起重要作用。由于MP与人体的心脏、大脑、肝脏等组织存在部分相同抗原,因此能通过自身免疫反应破坏具有相同抗原结构的组织。同时,MP黏附素和人淋巴细胞CD4分子主要组织相容性复合体及MHCII型具有同源的氨基酸序列,可发生细胞杀伤和自身免疫反应[10]。心肌炎、噬血细胞综合征、迟发性脑炎、SJS等的发生可能与MP通过上述机制引起有关[10]。

1.1.2 抗原变异

MP菌株根据P1黏附素基因不同分为P1-1型和P1-2型2种类型。P1不仅与体液免疫相关,还是参与黏附最主要的蛋白。通过黏附呼吸道上皮细胞、借助滑行运动定植,抵抗黏液纤毛的清除与吞噬细胞的吞噬发挥致病作用。GULLSBY等[11]近期报道了P1除已发现的变体2a、2b、2c,又发现新变体2e。其抗原的不断变异被认为与其基因组内重复序列的不断重组有关[12]。黏附蛋白P30、辅助蛋白P40亦具有较高免疫原性,其变异不仅影响MP致病性,也可使MP逃避机体免疫攻击。另外,中性粒细胞胞外陷阱(NETs)的捕杀病原体作用已被认定为中性粒细胞对抗入侵微生物的杀伤机制之一。在MP中,由MP491编码的核酶降解NETs,帮助MP躲避宿主细胞的免疫攻击[13]。现已观察到MP还可入侵人肺泡上皮癌细胞株(A549细胞)且存活较长时间,虽与细胞内存活有关途径仍待阐明,但仍可能使其免疫逃避成为可能[14]。

1.1.3 免疫球蛋白结合蛋白(IbpM)

IbpM是由MPN400编码的一种表面蛋白,与宿主产生的多种免疫球蛋白(IgM、IgG和IgA)紧密结合。它具有较高亲和力并能通过多种途径进入免疫系统发挥重要作用。此外,IbpM还可参与某些疾病如自身免疫性肝炎及肿瘤的发病过程。BLÖTZ等[15]研究证明,IbpM是MP在宿主细胞中产生细胞毒性作用所必需的,因而被认为是一种毒性因子。

1.2 炎症损伤

1.2.1 脂蛋白

现已知MP中发现了50多种不同的脂蛋白,其中许多脂蛋白均参与炎症反应。脂蛋白暴露在细胞中,固定在细胞质膜上,在邻近细胞中发挥作用[16]。MP脂蛋白可与Toll样受体(TLR)1、TLR2和TLR6识别,通过核因子κB(NF-κB)途径刺激促炎细胞因子释放,包括肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6和其他炎症介质等[17]。TAMIYA等[18]研究表明,TLR2依赖性IL-1α和IL-12、p40的产生在肺损伤后中性粒细胞浸润到肺部中起重要作用。这可能提示中性粒细胞浸润在MPP的加重中起到一定的确切作用。此外,核因子E2相关因子2(Nrf2)是一种转录因子,被认为是炎症反应和细胞氧化还原稳态的关键调节剂。HU等[19]研究发现,MP引起的一系列炎症反应在很大程度上取决于脂质相关膜蛋白(LAMPs),其可引起Nrf2的核易位,并且刺激Nrf2沉默的THP-1细胞,使活性氧和炎症反应物的水平升高,包括一氧化氮(NO)、前列腺素E2(PGE2)和细胞因子(IL-6、IL-8)。

1.2.2 脂质

MP的细胞膜脂质含量高(主要包括酸性甘油磷脂、鞘脂和胆固醇),甘油磷脂不仅是构成细胞膜脂质双层的主要成分之一,而且还参与各种生物活动,可浸润宿主上皮细胞,破坏细胞膜的脂质双层结构并导致离子代谢物泄漏。MP对脂质代谢有显著影响,特别是涉及甘油磷脂和鞘脂代谢的途径在MPP中的高表达表明MP感染诱导的膜融合损伤和免疫失调,可能与肺外并发症相关,与MPP的疾病严重程度有关,并且可能是RMPP的发生机制之一[20]。此外,肺泡巨噬细胞在肺部MP清除中起决定性作用[21],有学者推测MP中的高脂质可能是TLR4的潜在结合配体,MP与其结合后触发巨噬细胞自噬,促进炎症细胞因子的分泌,并在典型宿主细胞炎症反应中引起反应。但其具体机制尚不明确,可能涉及多种信号通路的调节、基因表达调控以及信号转导途径等多方面[22]。

1.2.3 产硫化氢酶HapE蛋白

HapE是一种在MP内最新发现的半胱氨酸脱硫酶,HapE蛋白能催化产生硫化氢引起红细胞裂解。GROßHENNIG等[23]通过研究MP引起的溶血首次证明HapE可以降解半胱氨酸形成H2S,其不仅导致红细胞裂解和破坏,还可诱导吞噬细胞分泌促炎因子,各种炎症介质和细胞因子的表达上调可以诱导或加重炎症反应,导致组织损伤。LI等[24]近期通过纯化HapE的实验也证明,该酶通过ATP敏感的钾离子通道介导相关炎症反应,可引起红细胞裂解,证明HapE是MP的一种新型潜在毒力因子。

1.3 社区获得性呼吸窘迫综合征(CARDS)毒素

由MPN372编码的CARDS毒素是由MP产生的独特腺苷二磷酸(ADP)核糖化和空泡化毒素,表现出与人肺表面活性物质蛋白-A(SP-A)、膜联蛋白A2(AnxA2)等的高亲和力,而SP-A被认为是肺部先天防御机制的重要屏障,与之结合后可表现出其特有的核糖化和空泡化细胞毒性,引起呼吸道上皮完整性破坏、细胞胞质空泡化和纤毛功能丧失等多种病理改变[25]。此外,CARDS通过激活与Nod样受体蛋白3(NLRP3)相关的炎症小体对哺乳动物产生细胞毒性,并进一步促进IL-1β的释放,IL-1β被认为是CARDS毒素诱导炎症产生的重要细胞因子[26]。

1.4 混合感染

MP感染可引起气道上皮细胞损伤,为病毒、细菌和其他非典型病原体等定植提供条件。由于各种病原学检测方法的不同,各文献中报道的混合感染发生率及病原体有所差异。ZHANG等[27]总结收治的396例RMPP患儿,107例(27.02%)与其他病原体合并感染,其中肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和金黄色葡萄球菌是最常见的感染细菌,人博卡病毒(HBoV)、人鼻病毒、呼吸道合胞病毒是最常见的感染病毒。与单一感染相比,合并感染者的发热病程更长,白细胞计数及CRP值更高、胸部X线表现为肺部弥漫性大面积炎症的比例更大(P<0.05)。这些研究表明,混合感染出现在MPP患儿中,并与疾病严重程度相关,可能是RMPP的致病机制之一。

1.5 大环内酯类耐药MP

目前普遍接受的耐药机制是基因突变。V23S结构域rRNA中最常见的点突变为A2063G,此外,一些研究还报告了A2064G突变,这将导致大环内酯类药物亲和力降低及其最小抑菌浓度(MIC)大幅增加[28]。尽管最近的荟萃分析[29]显示大环内酯类药物耐药性与疾病严重程度之间没有关联,但大环内酯类耐药是延迟有效治疗的重要危险因素之一,已发现肺炎支原体延迟有效抗菌治疗与免疫反应有关,免疫反应过强可能导致肺外并发症。ZHAO等[30]通过支气管肺泡灌洗液(BLAF)样本分析儿童RMPP致病原因,60例RMPP患儿中51例MP菌株对大环内酯类抗生素耐药(98.1%),远高于普通肺炎支原体肺炎(GMPP)20%左右的大环内酯类耐药率。

2.1 乳酸脱氢酶(LDH)

LDH是一种氧化还原酶,广泛存在于人体组织细胞胞质中,参与无氧糖代谢。有5个亚型：LDH1、LDH2、LDH3、LDH4和LDH5。LDH3在肺组织中含量最丰富。炎症过程中组织损伤通常可通过检测血清中的LDH值来监测。现已有较多研究[31-35]表明LDH在RMPP时显著上调,是RMPP较可靠的预测指标之一,其截断值范围为375.5～436.5 U·L-1(表1)。郑雪香等[31]以384.5 U·L-1为截断值进行多因素Logistic回归分析,显示LDH是RMPP的独立危险因素,其比值比(OR)为1.006。INAMURA等[32]研究发现,LDH≥410 U·L-1可能是推荐皮质类固醇初始治疗的指标。LIU等[33]研究发现,其同工酶(LDH4+LDH5)联合预测可能同样是预测RMPP和开始皮质类固醇治疗的良好预测指标,ROC曲线下面积(AUC)为0.829,当截断值为109.4 U·L-1时,预测的特异度为87%,敏感度为75%。但该研究的样本量偏小(RMPP组16例),需要更大样本量的相关研究及更加直接的证据来说明RMPP中LDH5、LDH4高于LDH3的原因。

表1 LDH对儿童RMPP的预测价值

2.2 血清铁蛋白(SF)

SF是公认的人体重要储铁蛋白及炎症反应的双重指标。明显升高的SF水平反映铁代谢的紊乱,是判断疾病严重程度和预后的信号[36]。在感染的早期阶段,活化的巨噬细胞被刺激合成并释放TNF-α、IL-6等细胞因子,从而刺激铁蛋白的合成。高水平的SF通过抑制淋巴细胞增殖发挥免疫抑制作用[37]。在呼吸系统,SF水平升高,能反应肺部炎症和组织损伤的程度。CHOI等[37]研究显示,SF可作为儿童RMPP的早期预测生物标志物之一。当SF截断值为230 pg·mL-1时,预测RMPP的敏感度和特异度均为67%。WEN等[34]研究显示,SF与儿童RMPP严重程度相关,可能是开始皮质类固醇治疗的指标,AUC为0.90,当SF截断值为329 ng·mL-1时,对其进行多因素Logistic回归分析,显示SF是RMPP的独立危险因素,其OR值为1.00。且SF的低成本及在各级医院的广泛应用能增加其适用性及实用性。但仍需要进行更多的研究以确定适合临床开展工作的截断值范围。

2.3 C反应蛋白(CRP)

CRP是由肝细胞合成的急性时相蛋白,被广泛用作全身炎症反应的一种非特异性感染生物标志物。通过激活补体和加强吞噬细胞的吞噬作用来消灭病原微生物和受损害的组织细胞。近年来一些研究[5,34]表明,RMPP组的CRP水平在统计学上显著高于GMPP组,可作为预测RMPP的有效指标之一。WEN等[34]研究显示其AUC为0.81,当CRP的截断值为43 mg·L-1时,预测的特异度为82.73%,灵敏度为62.03%,对其进行Logistic回归分析,显示CRP为RMPP的独立危险因素,OR值为1.02。

2.4 D-二聚体

D-二聚体是纤维蛋白最简单的水解产物,是血栓事件的独立预测因子。近年来MPP发生血栓的报道并不少见[5,38]。其在预测肺炎严重程度和预后方面的临床价值正逐渐被认识,可用于评估MPP的严重程度[39-40]。MP的直接感染和免疫反应异常导致全身炎症,随后血管内皮损伤、皮下胶原暴露和血管收缩,破坏血液凝固和抗凝系统的平衡,导致高凝状态和较高的D-二聚体水平[5]。特别是D-二聚体>11.1 mg·L-1,有助于提示RMPP伴血栓形成[41]。于是,有学者[34]研究了D-二聚体在预测RMPP感染方面的作用,发现其可有效预测RMPP发生,AUC为0.87,当D-二聚体≥2.1 mg·L-1时,此截断值预测特异度为81%,敏感度为79%。HUANG等[42]在对124例RMPP患儿进行研究后发现,以0.738 mg·L-1为分界值对D-二聚体进行多因素Logistic回归分析,显示D-二聚体是RMPP的独立危险因素,OR值为1.002。

2.5 RMPP免疫相关的预测因子

2.5.1 IL-17A

IL-17A是IL-17的家族成员,IL-17是一种关键的促炎因子。当机体受到感染刺激后,Th17等细胞释放IL-17。IL-17通过对IL-6、IL-β、TNF-α表达的协同及诱导作用构成肺部感染的正反馈通路,故认为IL-17与肺实变演变有关[43]。有研究[44]发现IL-17A在肺部炎症性疾病发展中起着重要作用,可促进肺部炎症并且参与肺纤维化。ZHAO等[35]分析了RMPP和GMPP 2组儿童,发现血清IL-17A是预测RMPP的敏感预测因子,AUC值为0.822,当IL-17A>10.8 pg·mL-1时,其预测敏感度为77.8%,特异度为77.1%。

2.5.2 IL-18

IL-18是巨噬细胞为主的多种免疫细胞产生的一种促炎细胞因子,可协同IL-12一起诱导T细胞产生,促进对Th1型细胞因子的应答,从而诱导干扰素(IFN-γ)的产生;并且激活自然杀伤细胞以增强其毒性,参与先天和获得性免疫调节反应[45]。ZHAO等[35]研究发现,血清IL-18值同样是RMPP良好的预测指标,AUC为0.775,当血清IL-18水平高于464.5 pg·mL-1时,预测敏感度为82.2%,特异度为59.6%。

2.5.3 IL-6

IL-6是一种由T淋巴细胞、抗原递呈细胞(巨噬细胞及树突细胞)等分泌的多效性细胞因子,以前被称为B细胞分化因子、血小板生成因子、肝细胞刺激因子等。当其与受体结合后,经过信号转导,不仅具有调节免疫系统、诱导肝细胞合成急性时相蛋白等生理功能,而且能介导炎性反应等多重病理损伤,在许多疾病中发挥重要作用[46]。IL-6已被证明可作为评估重症肺炎患儿预后的敏感标志物,其持续升高是预后不良的标志[47]。ZHANG等[48]在一项对634例儿童的研究中发现,RMPP组的IL-6水平高于GMPP组(P<0.01),当IL-6≥14.75 pg·mL-1时,该截断值的预测敏感度为83.5%、特异度为63.4%,以此作为分界值进行多因素Logistic回归分析显示,显示IL-6是RMPP的独立危险因素,OR值为2.314。但是,IL-6的检测相对昂贵,并且在测量精度方面具有相对较高的实验室要求。因此,IL-6在基层医院等临床环境的应用可能受限。

2.5.4 高迁移率族框蛋白1(HMBG1)

HMBG1是巨噬细胞和其他炎症细胞在免疫反应过程中产生的一种可与DNA结合并导致几种炎症标志物转录的蛋白质。可促进炎症标志物和细胞因子产生,如IL-6、TNF、INF-γ等。DING等[49]通过对RMPP病例的HMBG1、TNF-α和IL-6水平比较得出：HMGB1比TNF-α和IL-6可能更具有良好的RMPP鉴别能力(P<0.05),AUC为0.876,其截断值为5.25×10-3时预测的特异度为82.4%,敏感度为83.3%。表明其是鉴别RMPP与GMPP的一种较好的生物标志物。且HMBG1对于明确混合感染较有意义,结合多重PCR病原学诊断更有临床应用价值[50]。如前所述,混合感染可能是RMPP的发病机制之一,因此高HMBG1在RMPP预测方面价值有待更进一步的研究。

许多生物标志物对于早期RMPP预测具有良好价值,但单一因素的作用有限,联合几个或多个生物标志物可提高RMPP早期预测的灵敏度和准确度。有研究[34,37]显示血清LDH、IL-18联合SF或CRP联合SF可作为预测RMPP的联合生物标志物。近年来用于预测儿童RMPP的Nomogram(诺莫)分析逐渐增多,旨在建立一种简单易用的列线图模型,便于临床医生在早期完成对RMPP的预测和及时治疗。SHEN等[5]分析确定LDH、CRP、D-二聚体是RMPP的重要预测因子,开发构建的列线图模型在训练集中AUC为0.881,在验证集中为0.777;BI等[51]分析确定年龄、发热时间、CRP、ALT、LDH和胸部影像学评分为预测因子,建立的列线图模型在训练集中AUC为0.889,在验证集中为0.881。这些列线图模型显示出在早期预测RMPP中的良好价值,有助于临床医生更早地识别RMPP。

综上所述,儿童RMPP常由过强免疫损伤引起,可出现各种肺内外并发症;其多种炎症因子的水平与GMPP儿童显著不同,可作为RMPP的良好预测指标。LDH、SF、CRP、D-二聚体、血清IL-6水平变化对RMPP的预测有意义,均为其独立危险因素。其中,LDH及SF被认为可能是开始皮质内固醇治疗的有效预测指标。有学者[50]认为LDH同工酶对RMPP的诊断有意义,对其他病原体感染的意义尚不明确。其次,有一个值得注意的问题,不同年龄段患儿免疫功能不同,是否会对细胞因子预测RMPP的检测值产生影响需要进一步的研究加以解析。另外,RMPP的早期预测不应局限于单一预测指标,联用多个已得到科学论证的生物标志物,有助于减少由RMPP导致的严重并发症及后遗症,使患儿早日恢复健康。

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