消光系数法与二喹啉甲酸法测定多肽浓度精密度的比较*

张璐瑶, 朱 伟, 李瑛傑, 张博燃, 曾 凯, 魏 蔚, 马净植, 杨 焰△

1华中科技大学同济医学院附属同济医院口腔医学中心,武汉 430030 2四川省绵阳市中医医院口腔科,绵阳 621053 3武汉市中医医院口腔科,武汉 430010 4华中科技大学协和深圳医院口腔科,深圳 518052 5湖南中医药大学口腔医学院(长沙市口腔医院),长沙 410023

少于50个氨基酸组成的相对分子质量低于10000的分子被称为多肽,它们是通过肽键连接且缺少稳定3D结构的短氨基酸链[1]。多肽参与了许多细胞过程的调节,如氧化还原稳态、激素调节、细胞信号传导、神经元信号转导、免疫反应和生长,也可以模拟蛋白质的生物活性而发挥相应功能[2]。在对多肽研究过程中,研究者们发现多肽溶液极易吸附于玻璃和塑料容器中造成浓度损耗[3],因此,快速、简便、可靠地测定浓度低、样本量小的样品中多肽的含量具有重要意义[4]。

随着蛋白质组学的不断发展,出现了许多测定蛋白质浓度的方法,这些方法用于多肽浓度的测定时表现出各自的优势与不足。消光系数法利用色氨酸与酪氨酸在波长280 nm处的吸光度来计算多肽浓度值。比色测定法如BCA法也常被用来测定多肽浓度[5],该法应用BSA作为标准品绘制标准曲线计算多肽浓度时,由于BSA属于大分子蛋白,在分子长度、分子量等方面与多肽存在较大差异,因此计算得到的多肽浓度值可能会与实际浓度值出现偏差。为了探讨BCA法标准品对浓度计算值的影响,课题组提出改进二喹啉甲酸法(BCA)法,拟将多肽代替BSA作为标准品来绘制个性化的标准曲线,由此计算浓度值可能更加准确。考虑到消光系数法要求检测的多肽必须含有色氨酸或酪氨酸,因此课题组选取长度相同、结构相似、含有色氨酸或酪氨酸的3条固相合成环肽(CYE、CLP、CHY)作为研究对象,最终比较消光系数法与不同标准曲线的BCA法测定多肽浓度结果与理论值之间的差异,以期为快速而简便地测定多肽浓度提供方法参考。

1.1 环肽的固相合成

委托生工生物工程上海股份有限公司合成环肽CYE(NH2-CYENLRSTC-COOH,C1-C9二硫键成环)、CLP(NH2-CLPLWYPSC-COOH,C1-C9二硫键成环)及CHY(NH2-CHYPTYSKC-COOH,C1-C9二硫键成环),并鉴定分子量与纯度。

1.2 BSA与多肽溶液的制备

按照说明书将BCA法蛋白质浓度测定试剂盒(BCA Protein Assay Kit,C503021)中的牛血清白蛋白(BSA,生工生物工程上海股份有限公司,中国)梯度稀释为0、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL。将多肽冻干粉(生工生物工程上海股份有限公司,中国)溶解为1 mg/mL的溶液,同样梯度稀释为0、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL。

1.3 消光系数法计算浓度

清洁并校准微量紫外分光光度计(ND-1000,Thermo,美国)。按浓度梯度吸取2 μL不同浓度的BSA、CYE、CLP及CHY溶液分别测定吸光度值(A280nm),设置6组重复样本。利用色氨酸残基(W)和酪氨酸残基(Y)的消光系数计算各浓度梯度下的BSA、CYE、CLP及CHY溶液浓度。计算公式如下所示:肽浓度(mg/mL)=(A280nm×DF×MW)/e。其中,A280nm为波长280 nm下溶液的吸光度,DF(dilution factor)为稀释系数,MW(molecular weight)为肽的分子量,e为W和Y残基的摩尔消光系数之和(色氨酸消光系数为5560 [mL/(mg·cm)],酪氨酸消光系数为1200 [mL/(mg·cm)]。

1.4 BCA法与个性化标准曲线的BCA法计算浓度

1.4.1 工作液的配制 将BCA法蛋白质浓度测定试剂盒中的A液与B液混匀(50∶1),制成BCA工作液。

1.4.2 BSA标准曲线计算浓度 在96孔酶标板上各孔分别加入20 μL各梯度浓度的BSA、CYE、CLP及CHY,每个浓度设置6个重复样本。随后在各样本孔中依次加入200 μL的BCA工作液,迅速混匀。在37°C中保温30 min后,将测试液冷却至室温,在酶标仪(Synergy HTX,Biotech,美国)上测各孔在波长562 nm处的读数,记为A562nm。按照浓度梯度的顺序,以BSA各孔A562nm读数的平均值为纵坐标,对应的浓度为横坐标,在Microsoft Excel软件中绘制标准曲线,得到标准曲线方程式。将CYE、CLP及CHY各孔A562nm读数代入BSA标准曲线方程式,求浓度计算值。

1.4.3 个性化标准曲线计算浓度 按照浓度梯度的顺序,纵坐标分别为CYE、CLP及CHY各孔A562nm读数的平均值,横坐标为对应的浓度,在Microsoft Excel软件中绘制标准曲线,得到3条个性化标准曲线方程式。将各孔A562nm读数代入个性化标准曲线,求浓度计算值。

1.4.4 BSA、CYE、CLP与CHY标准曲线计算自身浓度 方法同上,按照浓度梯度的顺序,纵坐标为BSA 3个重复样本A562nm读数的平均值,横坐标为对应的浓度,在Microsoft Excel软件中绘制标准曲线,得到标准曲线方程式。将BSA其余3个重复样本A562nm读数代入BSA标准曲线,求浓度计算值。同法,以多肽溶液的3个重复样本A562nm读数的平均值为纵坐标,对应的浓度为横坐标,在Microsoft Excel软件中绘制标准曲线,得到多肽个性化标准曲线方程式。将设置的多肽溶液3个重复样本A562nm读数代入自身标准曲线,求浓度计算值。

1.5 统计学方法

2.1 CYE、CLP及CHY的性质

表1、表2展示多肽的成分、组成与性质。对氨基酸进行分析,通过计算疏水分数,CYE表现出较好的水溶性,而CLP与CHY水溶性较差。

表1 多肽的高效液相色谱法(HPLC)与质谱法(MS)鉴定结果Table 1 Identification of polypeptides by High performance liquid chromatography and Mass spectrometry

表2 CYE、CLP及CHY的氨基酸组成Table 2 Amino acid composition of CYE,CLP and CHY

2.2 三种方法测定浓度结果的比较

2.2.1 消光系数法 利用微量紫外分光光度计测定BSA、CYE、CLP及CHY溶液在波长280 nm处的吸光度值,利用色氨酸残基(W)和酪氨酸残基(Y)的消光系数计算浓度。将浓度计算结果与理论值绘制趋势线进行比较(图1),实验结果表明:BSA、CYE、CLP以及CHY通过消光系数法计算的浓度计算值与理论值之间无明显统计学差异(均P>0.05)。R2均大于0.99,线性关系良好。计算值与理论值相对偏差为1.475%～5.125%,属于相对偏差允许值范围[7]。

图1 BSA、CYE、CLP以及CHY消光系数法浓度计算值与浓度理论值比较Fig.1 Comparison of calculated and theoretical concentration values of BSA,CYE,CLP and CHY solution calculated by extinction coefficient method

2.2.2 BCA法与个性化标准曲线的BCA法 根据BCA法(标准品:BSA)与个性化标准曲线的BCA法(标准品:CYE、CLP、CHY)的4条标准曲线得到的4个标准方程式,分别计算出BSA与多肽浓度(图2、表3)。标准曲线R2均大于0.99,线性关系良好。4条标准曲线的斜率由大到小依次为CHY>CLP>CYE>BSA(均P<0.05),与形成的紫色络合物颜色深浅相一致。

将各组浓度计算值与理论值相比较,如图3所示,在BCA法中,使用BSA标准曲线计算得到的多肽浓度计算值大于理论值,而使用CYE、CLP与CHY的个性化标准曲线分别计算BSA的浓度值,其计算结果均小于理论值(均P<0.05);使用CYE标准曲线计算CLP与CHY的浓度,二者计算值均大于理论值(均P<0.05);使用CLP标准曲线计算CYE与CHY的浓度,CYE浓度计算值小于理论值(P<0.05),而CHY浓度计算值大于理论值(P<0.05);使用CHY标准曲线计算CYE与CLP浓度,二者计算值均小于理论值(均P<0.05)。比较不同标准曲线下的浓度计算值与理论值之间的差值的统计学差异,结果表明,个性化标准曲线的BCA法的浓度计算值比BCA法的浓度计算值更接近理论值(P<0.05)。计算值与理论值相对偏差为43.36%～385.10%,超出相对偏差允许值范围[7]。

图2 BSA、CYE、CLP与CHY的标准曲线Fig.2 The standard curves of BSA,CYE,CLP and CHY solution

表3 BSA、CYE、CLP与CHY的标准曲线公式及R2值Table 3 Standard curve formulas and R2 values of BSA,CYE,CLP and CHY solution

图3 不同标准曲线计算同一蛋白或多肽的浓度计算值与理论值的比较Fig.3 Comparison of calculated and theoretical concentration values of the same protein or polypeptide calculated by different standard curve formulas

2.2.3 BSA、CYE、CLP与CHY标准曲线计算自身浓度 分别用BSA、CYE、CLP与CHY标准曲线计算自身浓度,其标准方程及R2如表4所示。计算结果表明BSA、CYE、CLP以及CHY通过自身标定计算的浓度计算值均与理论值无明显统计学差异(均P>0.05)(图4)。R2均大于0.99,线性关系良好。计算值与理论值相对偏差为0.3718%～12.83%,属于相对偏差允许值范围[7]。

表4 自身个性化标准曲线的BCA法标准曲线公式及R2值Table 4 Self-individualized standard curve formulas and R2 values of BCA method

图4 BSA、CYE、CLP以及CHY自身个性化标准曲线的BCA法计算值与浓度理论值比较Fig.4 Comparison of calculated and theoretical concentration values of BSA,CYE,CLP and CHY solution calculated by self-individualized standard curve formulas through BCA method

2.3 变异系数的计算

对不同方法下计算的浓度值进行变异系数(CV)的计算。由表5可知,不同方法下吸光度值变异系数均小于10%,表明测试方法的精密度均较好,可以用于测定多肽浓度。

表5 A280nm与A562nm测量值变异系数Table 5 Coefficient of variation for A280nm and A562nm

在一个多肽研究实验过程中可能需要对多肽连续取样测定浓度,同时,为了更好地利用多肽的低浓度效应、避免容器壁吸附对浓度的影响,简单快捷地测定多肽浓度十分必要。随着蛋白质/多肽组学的发展,浓度测定主要分以下几类:①依赖蛋白质固有的紫外光吸收能力的方法;②利用蛋白质结合染料进行比色或荧光检测的方法;③被还原的铜离子与显色剂形成络合物进行比色检测的方法;④荧光测定法;⑤免疫检测法。每一种检测方法各有优劣,目前实验室最常用的还是消光系数法和比色测定法[8]。

紫外吸收法中以吸收波长为280 nm的消光系数法最为常见,方法简单,适用于低浓度或低体积的多肽溶液[9],其原理是使用分光光度计测定芳香族氨基酸如色氨酸、酪氨酸等在波长280 nm处产生的吸光度,按照公式计算出相应浓度值。BCA法原理是在碱性条件下蛋白将Cu2+还原为Cu+,Cu+与BCA试剂形成紫色络合物。其中,发挥主要功能的是半胱氨酸、胱氨酸、色氨酸和酪氨酸残基。测定溶液在波长562 nm处的吸光度值,将其带入标准曲线即可计算待测蛋白的浓度[10-12]。BCA法与Lowry法[13]和Bradford法[14]比色测定方法原理相似,但大量研究表明BCA法在线性范围和敏感度方面均高于Lowry法与Bradford法[11-12,15]。因此,本次实验选择消光系数法与BCA法进行多肽浓度测定的研究。

BCA法以大分子蛋白BSA作为标准品,在绘制标准曲线计算浓度值时,结果的准确性可能存在一定偏差。因此,我们对BCA法进行改进,以长度相同、分子量相近的3条环肽CYE、CLP、CHY替代BSA作为标准品绘制个性化标准曲线来计算浓度值。本次实验选择了消光系数法、BCA法与个性化标准曲线的BCA法分别测定大分子蛋白BSA与小分子多肽CYE、CLP、CHY的浓度。本研究结果显示消光系数法计算值与理论值之间无明显统计学差异(均P>0.05),计算结果准确度较高,但只适用于含有色氨酸或酪氨酸的多肽。

在BCA法中,使用BSA标准曲线计算得到的多肽浓度计算值均大于理论值(均P<0.05);在个性化标准曲线的BCA法中,使用CYE、CLP与CHY的个性化标准曲线分别计算BSA的浓度值时,其计算结果均小于理论值(均P<0.05)。这可能与BSA分子量大、氨基酸数目多有一定的关系。在BCA法的显色原理中,半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸和色氨酸残基发挥主要作用[10-12]。在等量的BSA与多肽测试溶液中,分子量大的BSA反而总质量变小,显色氨基酸数目少于多肽,以BSA为标准品绘制标准曲线时,则高估小分子多肽的浓度。使用CYE标准曲线计算CLP与CHY的浓度,二者计算值均大于理论值(均P<0.05)。CYE、CLP与CHY均具有两个半胱氨酸。但是,在CYE序列中只含有一个芳香族氨基酸,即酪氨酸,而CLP与CHY序列中均含有两个芳香族氨基酸,所以在还原铜离子的强度上,CYE表现出较弱的能力。同时,CYE疏水程度弱于CLP与CHY,这种多肽的亲水性差异可能也会导致结果的偏差[9]。因此,使用CYE标准曲线计算CLP与CHY的浓度时,二者计算值均大于理论值。使用CLP标准曲线计算CHY的浓度,CHY浓度计算值大于理论值(P<0.05);使用CHY标准曲线计算CLP浓度,CLP浓度计算值小于理论值(P<0.05)。CLP与CHY的芳香族氨基酸个数与疏水性相似,这种浓度差异可能是由CHY序列中存在赖氨酸,也就是在碱性的实验条件下,赖氨酸能与铜离子发生反应所致[16]。

回顾近年来BCA法等进行蛋白定量的研究文献,大多关注的是大分子蛋白测试速度、回收率与变异系数等定性指标,并无明确小分子多肽定量测试的比较研究[17-19]。本研究发现消光系数法对含有色氨酸与酪氨酸的多肽的浓度测定具有准确性较高的优势,但不能用于不含有色氨酸与酪氨酸残基的多肽,并且该方法操作比较耗时,技术敏感性要求高。BCA法具有操作简单、节约时间、重复性佳等优点,但直接使用BCA法计算多肽浓度值时得到的结果不准确。比较BCA法与个性化标准曲线的BCA法的浓度值计算结果,使用分子量相近的标准品绘制标准曲线以求未知浓度的多肽浓度时,浓度计算值与理论值之间仍然有统计学差异,但比BCA法的浓度计算值更接近理论值。也就是说,个性化标准曲线的BCA法在一定程度上减小了BCA法的误差。

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